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我叫骨头，是万事屋的大腿挂件。最近的课题是LncRNA，LncRNA，LncRNA，重要的事情说三遍，但是我的LncRNA到底是不是LncRNA呢？我怎么陷入到了这样一个漩涡里呢！？

先不要靠师兄师姐，我就自己找找看吧，有一篇这样的Cell上的文献：

这篇文献里提到：“The non-coding nature of lncARSR was confirmed by coding-potential analysis (Figure S1M).”然后我看了一下Supplement Figure。

Fig. legend是这样写的：(M) Upper: Prediction of putative proteins encoded by lncARSR using ORF Finder. Lower: The codon substitution frequency scores (CSF) of lncARSR. 

首先我明白一件事，就是要先分析这个lncRNA的ORF，也就是开放式阅读框。但是接下去要做什么呢？CSF又是啥？师姐，我要怎么办？？？

莫愁：这个啊，其实不是很复杂啦，我们就拿这篇文献来做例子吧。首先，我们找到这篇文献描述的这个lncRNA是啥。

就是上面这个编号的lncRNA。接着我们，登陆到NONCODE（http://www.noncode.org/）上去，把这LncRNA序列调出来：

得到这个序列：

那接下来，验证这个RNA到底是不是lncRNA呢？首先我们要了解的，就是lncRNA是不能编码的，那就没有足够的ORF，也就是开放式阅读框。那我们就登陆到PubMed的ORFfinder（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）上去。

调整一下，看看到底有多少个氨基酸（aa），我就调到了最低30个氨基酸的选项：

搜索获得的结果发现，没有一个ORF是超过200nt的，这就说明可能是非编码的RNA。接着，我们把所有正义链（标识+的ORF）进行BLAST。

BLAST结果发现这些短肽都没有同源性的蛋白质，这就更进一步说明了，这RNA可能不表达蛋白。

接着我们来看CSF，CSF到底是啥？CSF其实就是密码子的突变率。理论上编码区的密码子相对来说是保守的，也就是在物种中或者物种间是不容易产生突变，而非编码的就有点乱来了。我找到了这篇文献：

这是一篇在果蝇中用CSF来验证非编码与编码RNA间CSF差异的文献。其中显示，非编码的RNA突变率更高。

这篇文献用的是两个指标，一个是CSF（密码子替换频率，Y轴），另一个是RFC（阅读框保守性，X轴），见下图：

可以看到ncRNA的CSF值都小于0。由于序列保守性的问题，所以在这个CSF值的基础上，Michael又延伸出了一个新的，引入进化模型的值PhyloCSF。现在用于验证lncRNA的大多数是PhyloCSF值，详见下面这篇文献哈：

那问题来了，我们要怎么分析序列的PhyloCSF值呢？首先，要登录到强大到不要不要的UCSC上，随便进一个序列，我选了一个LncRNA——HOTAIR。然后点击“Track hubs”按钮。

进去之后，选择“My Hubs”。

在里面添加这个网址，我知道你们懒，所以不能惯着你们：

接着点击确认（上面看不清就看下面）：

然后会弹出UCSC的封面，输入HOTAIR后进入：

结果会直接显示HOTAIR的PhyloCSF值，可以明显地看到，在HOTAIR的外显子上所有的值都是小于0的，也就是没有保守型。

那我们把那篇Cell中的lncRNA的序列位置输入进去，然后……

可以看到，也没什么保守性。以此我们可以初步判断，这个RNA极有可能不能编码蛋白质，也就是lncRNA。

…华丽丽的分割线…

李莫愁博士：我估计好多人不会来看这个帖子呢，因为太长了，但这是一个LncRNA确认的基本步骤。最实际的，就比如通过二代测序后获得有差异的，可能不能编码蛋白的RNA，那要用什么来验证呢？这篇Cell告诉我们要用ORF和CSF来验证是否是LncRNA。

其实验证ORF之前，其实还有一个问题大家可能也不会去注意，那就是Kozak序列，Kozak序列是核糖体结合位点，没有这个，其实再怎么样的阅读框也没办法翻译成蛋白。然而有一些LncRNA是具有翻译短肽功能的，还有一些假基因，这就很难用这样的方法来确认了。好了，今天就策到这里吧。

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