《自然》：中国科学家打开糖蛋白激素作用机制“黑匣子”

在我国，每8对夫妇中就有1对有不孕不育问题，而甲状腺癌的发病率也以每年12.4%的速度增长。糖蛋白激素是辅助生殖、治疗甲状腺等疾病的关键药物。虽然近几十年来，糖蛋白激素的临床应用已经取得很大成功，但它如何激活人体细胞中的受体机制，是长期以来科研人员难以打开的“黑匣子”。

激素作为人体的化学信使，控制着各个器官的生理功能，而下丘脑和脑下垂体是内分泌激素的控制中心。传统内分泌系统由下丘脑-垂体-性腺轴（HPG）、下丘脑-垂体-甲状腺轴（HPT）和下丘脑-垂体-肾上腺轴（HPA）三大分支组成。

糖蛋白激素主要分为两类，均为重要的临床治疗药物。一类是促性腺激素，包括促黄体生成素(LH)、促卵泡激素（FSH）和绒毛膜促性腺激素（CG），它们对调控HPG轴的关键生理功能具有重要意义。其中，FSH和LH可以用于辅助生殖及体外受精，以及治疗女性不孕症和男性促性腺功能减退症等；CG可以用来诱导女性排卵，增加男性精子数量等。

而另一类糖蛋白激素是促甲状腺激素（TSH），它是HPT轴调节的关键糖蛋白激素，主要通过调控机体甲状腺素的水平来调节人体代谢。TSH与¹³¹I联合可应用于甲状腺癌术后患者，抑制和消融残余癌组织等。

虽然糖蛋白激素在临床应用取得了成功，但它如何激活人体细胞中的受体机制始终未解，这极大地限制了人们对该类受体的激素选择性，以及受体激活机制的理解。此外，结构信息的缺乏也制约了靶向该类受体的小分子治疗药物的研发。 

实际上，糖蛋白激素受体结构的难解，与其结构的特殊性有密切关系。糖蛋白激素受体为A类G蛋白偶联受体（GPCR），但与大多数A类GPCR不同，它包含由340-420个氨基酸构成的巨大N端胞外区结构域（ECD），该结构域由富含亮氨酸的重复序列构成，且存在复杂的糖基化修饰。

徐华强告诉《中国科学报》，“因为特殊结构，糖蛋白激素受体很难重组表达。此外，糖蛋白激素受体除了传统的跨膜区，还有一个较大的胞外区，这也造成它的表达非常不稳定。”

体外获得全长的激素受体可谓困难重重。该论文的第一作者，中科院上海药物所博士研究生段佳，在刚入学时，就“钻”了这项研究。由于此前没有糖蛋白激素及其全长受体复合物结构的相关报道，他们只能摸着石头过河。

“摆在我们面前的第一个难题就是CG配体。一般情况下，我们都是自己表达纯化配体，但‘折腾’了2个月后，发现效果并不理想。”段佳告诉《中国科学报》。

在一次上网查资料时，她惊喜地发现医院有现成的CG处方药，“如果使用处方药，可能效果会不错。”果然，后续的实验证明了这一猜想。为了获得更多的CG配体，他们又多方联系买到了药物的原料药，进而解决了CG配体的难题。

后续的困难接踵而至。段佳发现，常规方法制备出的蛋白量不仅很少，而且结果也不稳定。通过查阅大量文献，她发现，糖蛋白激素受体存在很多点突变，而这些突变会引起一系列疾病。为此，她对文献中涉及的所有突变进行了筛选，最后锁定了能够使受体持续性激活的突变S277I。“通过引入这一突变，不仅让受体更加稳定，还提高了受体的表达量。”

在单颗粒冷冻电镜技术的“加持”下，研究团队最终解析了3个近原子分辨率的全长LHCGR处于激活状态下的结构，包括结合内源性激素CG的LHCGR（野生型）受体结构（4.3埃）、结合内源性激素CG的LHCGR（含持续性激活突变S277I）受体结构（3.8埃）以及结合内源性激素CG和小分子化合物Org43553的LHCGR（含持续性激活突变S277I）受体结构（3.2埃）。

图：糖蛋白激素结构模式图及LHCGR受体与CG和Gs蛋白复合物的冷冻电镜结构

解开激活状态下的全长LHCGR结构谜团，对于研发团队而言只是第一步。“很多现象，仅靠解析激活状态下的结构是不够的。”段佳说，“以往解析GPCR时，都是配体与受体的跨膜区相互作用后，引起跨膜区的构象变化，进而激活受体。但对于糖蛋白激素受体的激活，配体仅仅与受体胞外域相互作用，在没有接触到受体跨膜区的情况下，仍然能够引起跨膜区构象的变化。”

这意味着，只有继续解析失活状态下的糖蛋白激素受体结构，才能完整地揭示该类受体的激活机制。虽然激活状态下的解析工作为后续研究奠定了重要基础，但仍然遇到了很多困难。

“在开展这项研究之前，没有任何单独GPCR的冷冻电镜结构报道。而糖蛋白激素受体非常不稳定，可能纯化过程中就降解了。”段佳说。

通过查阅文献，研究团队又尝试了很多办法，例如在蛋白上加上融合标签等，但效果并不明显。他们想，也许在纯化蛋白的过程中加入小分子抑制剂能使蛋白更加稳定。

通过这种方式，研究团队克服了全长失活受体构象高度不稳定的技术难题，并通过扩大数据量，最终解析了失活状态下全长LHCGR的电镜结构，分辨率为3.8埃。

通过对比激活LHCGR结构，研究人员发现受体的ECD发生了大约45度的偏转。进一步通过结构分析和功能试验验证，他们最终提出了LHCGR受体“Push and Pull”的受体激活模型，也就是糖蛋白激素受体激活的“推拉”模型。“这是第一个全长单独GPCR的电镜结构。”徐华强说。

图：LHCGR失活状态电镜结构与激活状态结构比较以及受体激活模型

近年来，小分子药物研发逐渐表现出巨大优势，也越来越受到患者和市场的青睐。

徐华强表示，“一方面，小分子药物可以口服，相对于打针等治疗方式，可以减少患者身体痛苦和心理负担；另一方面，小分子药物可控性和依从性更强，可以做到定时定量。”

为此，研究人员还解析了处于1期临床试验中的小分子化合物Org43553与LHCGR相互作用的分子细节，揭示了Org43553的结合口袋，为临床开发针对LHCGR、FSHR和TSHR的选择性小分子药物替代激素治疗提供了重要的结构模板。

实际上，国内外对糖蛋白激素的关注由来已久。十年前，徐华强团队就开始研究糖蛋白激素受体的结构，但受限于当时的结构解析技术，研究仅开展两年便被迫搁置。

随着冷冻电镜技术的革命，两年前，徐华强团队联合合作者再次重启这该项目。在他看来，除了技术的进步，研究之所以成功，还得益于中科院上海药物所的技术和平台支撑，不同方向团队的精诚合作，以及学生们善于发现问题并解决问题的主观能动性。

“糖蛋白激素受体结构的解析只是第一步，也是最关键的一步。虽然糖蛋白激素的作用机制在整个家族是通用的，但与受体之间也存在特异性，仍然需要结构生物学来解答。此外，我们还希望进一步解析促卵泡激素和促甲状腺激素等受体的结构，揭示不孕不育、甲亢或甲减等疾病的分子机制，为治疗相关疾病药物的研发提供结构基础。”徐华强表示。

相关论文信息：

https://doi.org/10.1038/s41586-021-03924-2

编辑 | 余   荷