文献解读|WTAP介导的lncRNA NORAD的m6A修饰促进椎间盘退变（IVDD）
期刊、影响因子：Nat Commun.（14.919）
导读
2022年3月华中科技大学同济医学院附属协和医院团队为了探究RNA m6A修饰在调控椎间盘退变(IVDD)的作用机制，通过m6A-seq测序发现，lncRNA NORAD在衰老的髓核细胞(NPCs)中的甲基化显著增加，同时发现WTAP在衰老的NPCs中表达上调，这是由于KDM5a介导的启动子H3K4me3的表观遗传增加，并显著促进了NORAD m6A的修饰，而YTHDF2介导的NORAD在衰老NPCs中降解增强，而NORAD的缺失导致PUMILIO蛋白的隔离减少，从而增强PUM1/2的活性，从而抑制靶基因E2F3 mRNA的表达，促进细胞衰老。研究提示上述发现可以作为一个潜在的治疗靶点，以抑制NPCs的衰老和IVDD的发展。
科学问题
RNA m6A修饰是转录后水平上最常见的RNA修饰，参与各种疾病和细胞过程。然而，目前RNA m6A调控在椎间盘退变(IVDD)的潜在作用机制尚不清楚。
实验设计
样本类型：细胞系
分组分析：衰退的髓核细胞(senescent NPCs)和正常的髓核细胞(Normal NPCs)，每组3个生物学重复
技术手段：m6A-seq（MeRIP-seq）
实验思路
实验结论
已有研究报道IVDD发生同时伴有内髓核（NP）衰老和髓核细胞（NPC）衰老。为了进一步探讨NP衰老在变性过程中的机制，作者分析了衰老相关标记物（p16和p21）在NP组织中的表达，并验证了这些标记物在衰老NP组织中的表达高于正常组织（Fig.ab）。通过TNF-α建立体外NPC衰老模型，通过RNA-seq进一步探讨NPC衰老的病理机制。GSEA结果显示，TNF-α对NPCs的作用富集在细胞的老化和衰老（Fig.c）, 细胞和组织的差异表达基因相似。上述结果表明，IVDD过程中，髓核衰老伴随NPC的衰退。
为了进一步探究lncRNA的m6A修饰是否影响NPCs的衰老，作者通过MeRIP-Seq发现m6A修饰的lncRNA NORAD在衰老的NPCs中显著增加，而转录本表达下降（Fig. f），同时也通过FISH实验得到验证（Fig. j），在组织样本中也观察到同样的变化（Fig. I,k）。Fig. a-e是对正常NPC和衰老NPC整体m6A修饰情况的展示，m6A修饰主要富集在终止密码子附近，motif分析显示GGAC显著富集。
WTAP在衰老NPC中显著高表达，在WB实验中也得到验证（Fig. ab）。已知组蛋白修饰是一种关键的细胞表观遗传修饰，通过调节染色质可及性影响基因表达，并已被证实是细胞老化的关键因素。为了确定是否可以通过这些表观遗传修饰调控WTAP的表达，作者首先分析了WTAP启动子区的组蛋白修饰情况。ChIP-PCR结果显示，组蛋白H3K4me3修饰在衰老的NPC中最为显著（fig. a b）。为了阐明其具体的机制，我们通过RT-qPCR分析H3K4me3的赖氨酸甲基化酶和去甲基化酶的表达，包括MML1- 5和KDM5a-d，发现去甲基化酶KDM5a的表达在衰老的NPCs中最显著下降，WBs实验进一步证实了这一结果（fig. e,f）。综上进一步证实WTAP的上调是由于KDM5a的降低介导H3K4me3的改变增加。
将m6A位点的A替换为G(Fig. b)，之后进行MeRIP-qPCR，发现位点突变降低了NORAD的m6A修饰，而表达水平大大提高(fig. c-e)。这些结果表明，增加的m6A修饰下调了NORAD转录本的稳定性。
之前的研究表明，YTHDF2/3和IGF2BP1/2/3等reader可以影响m6A修饰RNA的稳定性。为了识别与NORAD结合的reader，作者进行了RNA pull-down实验，然后对分离的蛋白进行WB分析。结果表明，YTHDF2与NORAD存在相互作用，进一步的CLIP-qPCR分析证实甲基化的NORAD与YTHDF2存在强烈的相互作用。上述数据表明，YTHDF2介导了m6A修饰引起的NORAD的降解。
总之,作者的研究提出一种通过m6A修饰调控NPC衰老的作用机制，揭示了干扰NORAD m6A修饰或靶向NORAD/PUMILIO/E2F3轴可缓解IVDD的进展，进一步为IVDD治疗提供了一种潜在的表观遗传治疗策略。
参考文献：
Nat Commun. 2022 Mar 18;13(1):1469. doi: 10.1038/s41467-022-28990-6.
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END
本文为伯豪生物原创
撰稿人：郭清艳
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