存活异常的CRC病人的突变时空异质性与免疫

写在前面

你现在看到的是文献俱乐部2019年笔记分享第一弹，我将会在春节7天连续分享，目录如下：

• 2019年1月份第1周（总第49周）单细胞转录组探索CAFs的功能和空间异质性

• 2019年1月份第2周（总第50周）异常CRC病人的突变时空异质性与免疫

• 2019年1月份第3周（总第51周）探索PDAC癌前病变

• 2019年1月份第4周（总第52周）TCGA计划的ATAC-seq数据发布

• 2019年2月份第1周（总第53周）胃癌类器官

• 2019年2月份第2周（总第54周）测173个成年人的大脑的102个基因

• 2019年2月份第3周（总第55周）2.5万汉族人的GWAS乳腺癌风险基因

因为学业需要，我阅读的大量文献都是NGS组学相关，所以会涉及到很多数据处理，而这些文献基于的生物信息学数据处理技巧，我都在过去的5年里以各种形式分享讲解过，也有系列视频，希望你可以在方便的时候再次学习一遍，查漏补缺。

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如果，你不仅仅是对NGS组学应用文献感兴趣，也欢迎加入我们文献阅读小组分享自己的主页领域文献。

逆向收费读文献社群（第二年通知）

今天是大年初一，给大家带来的是单细胞转录组探索CAFs的功能和空间异质性，希望你能学到知识。

文献概要

文章发表于2018年9月的CELL 是：Evolution of Metastases in Space and Time under Immune Selection

作者发现两个存活时间异常长的病人：P210 and P45 所以从他们的系列手术过程中取到了31个转移瘤的样品进行测序。

背景知识

结直肠癌（CRC）是常见的消化道恶性肿瘤之一，在中国所有癌症中的发病率和死亡率均处于前列。

约有 85% 的结直肠癌属于染色体不稳定（CIN）型，15% 左右为由 DNA 错配修复功能缺失引起的微卫星不稳定（MSI）型。

肿瘤免疫治疗是当前肿瘤治疗领域中最具有前景的研究方向之一，与直接攻击肿瘤细胞的放化疗不同，免疫疗法通过调节机体的免疫系统，减低/消除肿瘤对免疫细胞活性的抑制，恢复免疫系统对肿瘤组织的清除与控制，从而达到抗肿瘤的效益。

关于Immunoscore 概念

Galon教授团队之前报道过细胞毒性和记忆T淋巴细胞在原发肿瘤中的作用，并以此来预测癌症患者（包括早期癌症患者）的存活率，由此他们定义了导致肿瘤内特异性免疫细胞密度变化的机制。他们通过对进入到原发性肿瘤的核心（CT）和侵袭边缘（IM）两个部位中的淋巴细胞群进行定量，打造了一套基于免疫细胞密度的评分系统并命名为“Immunoscore”，效果甚至优于TNM分期对预后的价值，且Immunoscore在预测生存方面比微卫星不稳定性更有优势。 转移灶中免疫细胞进入量越多，immunoscore越高、TB score越高，则患者存活率越高，复发率越低。

参考文献

The Link between the Multiverse of Immune Microenvironments in Metastases and the Survival of Colorectal Cancer Patients ， doi.org/10.1016/j.ccell.2018.11.003

以肿瘤细胞为主线的4个进化模型：

• linear, branching, neutral and punctuated.

参考自文章： 2017 Jan 19. doi: 10.1016/j.bbcan.2017.01.003

本文作者的研究结果

病人取样测序

两个病人共31个区域（我实在是无法理解，病人的肿瘤都转移成这个样子了，居然还能存活）进行WES测序，如下所示：

这些样本的临床信息如下，从2010年到2015年一直在陆续手术取样。

WES测序细节如下：

测序仪，测序深度，外显子捕获芯片，都是中规中矩的， 数据分析流程也是BWA的GATK金标准。

肿瘤外显子数据分析流程通常就是找somatic的SNVs和CNVs，如下：

值得一提的是，作者把感兴趣的重要变异使用高深度的靶向测序进行了验证。

突变情况

一般来说cnvkit或者gatk的cnv流程都是很容易拿到肿瘤外显子的CNV信息的，当然作者这里选择的sequenza，其实大名鼎鼎的MSKCC出品的facets也是可以，结果如下；

可以很明显看到同一个病人的不同部位的测序结果的CNV相似性很高，两个病人的相似性尚可。 感觉吧，这样的分析结果跟很多以前的文章对不上。

对于点突变，通常是以突变全景图展示：

作者这里选择的是两款软件都找到变异位点作为最终SNVs列表，上图其实就是展示了突变的数量，热图就是突变的有无。同样好奇怪的是，那些经常出现在多处肿瘤部位的突变非常少，也就是说不同肿瘤部位的SNV一致性并不好，但是呢，前面却提到CNV的一致性挺好的。

然后整体比较原位癌症部位和转移癌症部位的突变情况如下：

可以看到在同一个病人的多个wes样本里面共有突变是非常稀有的，其中一个病人居然没有任何一个突变在其所有肿瘤部位测序到，另一个病人也仅有几个突变是其所有肿瘤部位都检测到的。

肿瘤克隆进化分析

前面得到的各种突变，都可以在同一个病人的不同测序部位比较有无，还可以更进一步就是分析进化关系，这里作者的主要分析方法是:

可以看到这个分析的大部分图都是在 文章的附件，但是鱼眼图却是文章精华

两个病人的SNVs突变进化关系如下;

当然也可以绘制CNVs的进化情况，在文章附件。

同一个病人的不同克隆的分布情况：

另外一种展现方式如下：

这些展示方式都是R包。

免疫分析

这里的Immunoscore指标是通过IHC实验手段获取的，来自于作者3个月前发表的文章。

The Immunoscore percentile is the mean of the four percentiles obtained for the two markers (CD3, CD8) in the two regions (CT, IM).

其分布情况：

探索一下免疫情况和肿瘤克隆情况的相关性：

还分析了CDR3区域多样性，TCR,BCR这样的免疫基因的 V,D,J区域组合。

文章亮点

这篇文章的分析花样还是很多的，可以说是把生物信息学数据分析恰当的应用到了自己的生物学故事里面，我感觉距离理解作者的思路还有点距离，就不点评了，大家自行仔细阅读文献吧。

不管怎么样，AI技术要过关。

免疫相关的

讨论

本文也采用了一些公共数据：

Metastatic ovarian cancer data Jimenez-Sanchez et al., 2017 Database: SRP095988

To estimate the Immunoscore percentile in the ovarian cancer dataset, we used the IHC measurements provided in the original study (Jimenez-Sanchez et al., 2017) and transformed them into percentiles using a larger set of ovarian cancers (Zhang et al., 2018).

后记

如果你完全没有看懂文章说了些什么，却仍然坚持到了最后，说明你有可能对生物信息学感兴趣，你缺乏的是一个入门的契机！

也欢迎推荐你身边的朋友参与我们的线下培训，如果有缘的话