RNA-seq入门实战（九）：PPI蛋白互作网络构建（上）——STRING数据库的使用
连续两次求贤令：曾经我给你带来了十万用户，但现在祝你倒闭，以及 生信技能树知识整理实习生招募，让我走大运结识了几位优秀小伙伴！大家开始根据我的ngs组学视频进行一系列公共数据集分析实战，其中几个小伙伴让我非常惊喜，不需要怎么沟通和指导，就默默的完成了一个实战！
他前面的分享是：
下面是他对我们b站转录组视频课程的详细笔记
承接上节：RNA-seq入门实战（四）：差异分析前的准备——数据检查，以及 RNA-seq入门实战（五）：差异分析——DESeq2 edgeR limma的使用与比较
本节概览：
1.STRING数据库基本介绍
2.STRING R语言版——STRINGdb的使用：
①STRINGdb数据库导入
②获取STRING_id
③PPI绘制
④clustering分簇
⑤富集分析
⑥获取蛋白互作信息
3.STRING 网页版的简单使用：
文件上传、各选项设置、数据导出
在得到我们感兴趣的基因集后，除了对其进行GO等富集分析查看与什么重要的生物学通路相关，还可以进行PPI蛋白互作网络（PPI, Protein-Protein Interaction Networks）的构建，查看这些基因之间的联系，进而锁定关键基因。关于关键基因、hub基因，这篇文章说得很详细：关键基因和hub基因（生物网络角度）。
构建PPI网络一般需要使用string数据库获取蛋白互作信息以及进行互作网络的可视化。下面探究一下STRING数据库的网页和R语言版的使用：其他数据库的使用：跟着Cell学作图|9.PPI分析(GeNets数据库)
1. STRING 数据库基本介绍
官网： STRING: functional protein association networks (string-db.org)R语言版本：Bioconductor - STRINGdb
STRING是一个已知和预测的蛋白质-蛋白质相互作用的数据库。相互作用包括直接(物理)和间接(功能)联系;它们源于计算预测、生物之间的知识转移，以及其他(主要)数据库聚合的交互作用。
STRING中的相互作用有五个主要来源：基因组预测、高通量实验、（保守的）共表达实验、自动化文本挖掘、数据库相关知识。
STRING数据库目前涵盖了来自5′090个物种的24′584′628个蛋白质。
2. STRING的R语言版——STRINGdb的使用
STRINGdb说明书：STRINGdb.pdf (bioconductor.org)或使用命令vignette("STRINGdb")在本地查看说明书。查看STRINGdb的函数帮助文档比较特殊，要用STRINGdb$help("get_graph")的形式。
使用STRINGdb时，参数species代表NCBI Taxonomy物种编码，可在此查询：https://cn.string-db.org/cgi/input.pl?input_page_active_form=organisms，其中人为9606，小鼠为10090 。
① STRINGdb数据库导入
首先选择载入的STRINGdb数据（数据库版本、物种、蛋白互作得分）和之前基因差异分析得到的DEG。
STRINGdb$new设置使用最新的11.5版本数据库，物种选择为小鼠（人9606，小鼠10090 ），蛋白互作得分阈值选择700（默认400, 低150，高700，极高900，越高可信度越强）。
DEG结果中选取前100显著差异基因用于后续分析，并将其基因名保存为gene_diff100.txt文件用于后续STRING网页版的使用（特别注意write.table要设quote = F，让字符不要带引号 ，否则后续上传 STRING容易识别错误）
rm(list = ls()) options(stringsAsFactors = F)library(tidyverse) # ggplot2 stringer dplyr tidyr readr purrr tibble forcatslibrary(STRINGdb) #BiocManager::install(c("STRINGdb","igraph"),ask = F,update = F)library(igraph)
setwd("C:/Users/Lenovo/Desktop/test")load(file = './3.DEG/test_DEG_results.Rdata')dir.create("7.PPI")setwd("7.PPI")######################### 选择STRINGdb类型 #########################string_db <- STRINGdb$new( version="11.5", #数据库版本。截止2022.5.24最新为11.5 species=10090, #人9606，小鼠10090 score_threshold=700, #蛋白互作的得分 默认400, 低150，高700，极高900 input_directory="") #可自己导入数据########################## 获取DEG结果 ############################## 筛选条件设置 log2FC_cutoff = log2(2)pvalue_cutoff = 0.05padj_cutoff = 0.05## 选择DEGneed_deg <- DEG_DESeq2[,c(2,5,6)] ; head(need_deg) colnames(need_deg) <- c('log2FC','pvalue','padj'); head(need_deg)need_deg$gene <- rownames(need_deg); head(need_deg) #gene symbol或ENTREZID都可if(T){ gene_up=need_deg[with(need_deg,log2FC>log2FC_cutoff & pvalue<pvalue_cutoff & padj<padj_cutoff),] gene_down=need_deg[with(need_deg,log2FC < -log2FC_cutoff & pvalue<pvalue_cutoff & padj<padj_cutoff),] gene_diff=need_deg[with(need_deg,abs(log2FC)>log2FC_cutoff & pvalue<pvalue_cutoff & padj<padj_cutoff),]}dim(gene_up);dim(gene_down);dim(gene_diff)dat <- gene_diff[1:100] ##这里选取前100显著基因用于后续分析write.table(rownames(dat),'gene_diff100.txt',row.names = F,col.names = F,quote = F) #字符不要带引号 ② 获取STRING_id
使用map获取基因名对应的STRING_id用于绘制string_PPI ， 基因名为gene symbol或ENTREZID都可以直接对应获取STRING_id
dat_map <- string_db$map(my_data_frame=dat, my_data_frame_id_col_names="gene", #使用gene symbol或ENTREZID都可 removeUnmappedRows = TRUE )hits <- dat_map$STRING_id ③ PPI蛋白互作网络绘制
完成以上步骤后使用plot_network即可绘制PPI图，还可以给PPI添加上下调信息（上调标记为红色光环，下调标记为绿色光环）
## PPIpng("string_PPI.png",units="in",width = 10,height = 10, res=400)string_db$plot_network(hits)dev.off()## PPI_halo #给PPI添加上下调信息# filter by p-value and add a color column(i.e.green for down and red for up genes)dat_map_color <- string_db$add_diff_exp_color(subset(dat_map, pvalue<0.01), logFcColStr="log2FC" )payload_id <- string_db$post_payload(dat_map_color$STRING_id, colors=dat_map_color$color)png("string_PPI_halo.png",units="in",width = 10,height = 10, res=400)string_db$plot_network(hits, payload_id=payload_id )dev.off()string_PPI.png
string_PPI_halo.png
④ clustering分簇
STRINGdb还能调用iGraph进行PPI的clustering分簇，get_clusters有这些算法可以选择: fastgreedy(默认), walktrap, edge.betweenness，以下代码演示了用 fastgreedy方法对PPI进行clustering，并展示前6个cluster
## iGraph clustering 互作网络分簇#algorithm: fastgreedy(默认), walktrap, edge.betweennessclustersList <- string_db$get_clusters(string_ids = hits , algorithm = "fastgreedy" ) # plot first 6 clusters.png("string_PPI_iGraph_cluster.png",units="in",width = 15,height = 10,res=400)par(mfrow=c(2,3))for(i in 1:6){ string_db$plot_network(clustersList[[i]])}dev.off()string_PPI_iGraph_cluster.png
⑤ 富集分析
除了以上功能，STRINGdb还能对基因集进行富集分析，参数category指定要使用的数据库（默认为All），其中Process, Component, Function分别对应GO的BP,CC,MF三个子集
#category: All, Process, Component, Function, Keyword, KEGG, RCTM, Pfam, SMART, InterProenrichment <- string_db$get_enrichment(string_ids = hits, category = "Process" ) write.csv(enrichment,"enrichment_GO_BP.csv")enrichment部分结果
⑥ 获取蛋白互作信息
最后，可使用get_interactions获取蛋白互作信息，再转换stringID为 gene symbol，去除重复（每个相互作用会出现两次），之后导出string_link.csv文件，可在Cytoscape中进一步进行多种可视化操作
############################## 获取蛋白互作信息用于后续可视化 ###############3dat_link <- string_db$get_interactions(hits)# 转换stringID为 gene symboldat_link$from <- dat_map[match(dat_link$from,dat_map$STRING_id),'gene']dat_link$to <- dat_map[match(dat_link$to,dat_map$STRING_id),'gene'] colnames(dat_link) <- c('node1','node2','combined_score')# 去除重复dat_link <- dat_link %>% distinct(node1, node2, .keep_all = T)
write.csv(dat_link,'string_link.csv',row.names = F,quote = F)3. STRING网页版的简单使用
登录STRING网页STRING: functional protein association networks。
在Mutiple proteins中上传我们前面得到的gene_diff200.txt，或者直接将基因名粘贴在第一个框中，再选择物种organism为Mus musculus。点击SEARCH，会进行匹配string中对应的蛋白，大致预览一下确认正确后，点击CONTINUE即可得PPI图像
SEARCH后界面
分析界面
在分析界面的Vierws选项下可以选择多种展现方式，Legend选项下展现图像各标记的含义；
Vierws选项 Legend选项 Settings选项下有多项参数可以选择，例如minimum required interaction score可以选择高可信度0.700（默认为0.400），选择完成后点击UPDATE即可更新图像。
可以看到调整可信度为0.700后与之前在R中所得图像是一致的
Settings选项
调整参数后所得图像
Analysis选项下有PPI网络的相关节点信息与GO、KEGG等富集分析结果
Analysis选项 Cluster选项下还可以对PPI网络进行分簇，选择分簇方法（如：kmeans clustering）和分簇数量（如：4）后点击APPLY即可，不同分簇会用不同颜色标注出来
Cluster选项
在Export选项下进行数据导出，一般选择下载高分辨率的PNG图片与蛋白互作关系TSV文件（下图黄色标记处），TSV文件用于后续在Cytoscape中进一步可视化PPI网络
Export选项
参考资料
STRINGdb.pdf (bioconductor.org)
用R的bioconductor里面的stringDB包来做PPI分析 | 生信菜鸟团 (bio-info-trainee.com)
【生信技能树】转录组测序数据分析_哔哩哔哩_bilibili
【生信技能树】GEO数据库挖掘_哔哩哔哩_bilibili
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