导 读

目前临床样本的保存仍以福尔马林固定后石蜡包埋（Formalin Fixed Paraffin Embedded，FFPE）为主，FFPE组织是世界上现存数量最庞大且临床资料最详尽的宝贵样本。然而，FFPE样本在制备过程中，其中的核酸分子容易发生修饰、降解及高度碎片化等，这限制了其在研究中的应用。2023年8月15日，Nicholas Navin团队在Cell报道了适用于FFPE组织的高通量单细胞DNA测序的方法：Arc-well（archival nano well sequencing），该方法为FFPE组织的高通量单细胞分析提供了新思路。

图1 图文摘要

针对FFPE组织的单细胞DNA分析具有一定的挑战性，其中，从FFPE组织中获得单细胞核是成功的关键，而Arc-well能很好的解决这一问题。将FFPE组织切成50微米厚的切片，经过去石蜡处理后分离成单个细胞核悬液，经流式分选富集细胞核，随后将核沉降到纳米孔芯片中并通过成像捕获单个细胞核，完成FFPE组织的单个细胞核的筛选和富集。随后使用裂解液将细胞核中的DNA释放出来并对其进行Tn5转座酶标记，添加独特的条形码组合，最后进行PCR扩增，收集编码的文库用于高通量测序。该团队利用Arc-well对存档了2-16年的原发和复发的乳腺导管原位癌（ductal carcinoma in situ, DCIS）和浸润性导管癌（invasive ductal carcinoma, IDC）的FFPE样本进行了回顾性研究，发现许多原发性DCIS已经经历了全基因组倍增和克隆多样化，并且它们与复发癌的持续亚克隆具有相同的基因组谱系。演化分析表明大多数复发肿瘤细胞是突破进化瓶颈从原发肿瘤中残留的肿瘤亚克隆中衍生出来的。同时，少数复发肿瘤从原发肿瘤向多克隆进化，表明通过手术或放疗治疗原发性DCIS未能清除所有残留肿瘤细胞。

Arc-well虽然实现了高通量的FFPE标本单细胞基因组分析，但仍存在一定的局限性。首先，Arc-well可能会错过细胞核外的DNA，因为细胞在裂解后只保留细胞核。其次，由于FFPE样品的测序质量较低，Arc-well获得的突变信息可能不完全准确，因此，不能使用Arc-well在单核苷酸水平上获得精确的遗传变异。另外，像其他单细胞测序方法一样，Arc-well只分析了一小部分的肿瘤细胞，仅能代表肿瘤的一部分。尽管如此，Arc-well基于当前测序数据质量生成的CNA图谱足以推断癌症亚克隆的系统发育树，并将其用于肿瘤异质性分析和癌症进化模型的构建。未来，Arc-well还可以应用于更多的癌症和其他疾病中，用以研究肿瘤的发生、发展和治疗反应、耐药性以及回顾性研究。

近年来，单细胞转录组和空间转录组学技术也在FFPE组织上取得了突破。M20 Genomics 团队报道了一种新的基于随机引物的高通量单细胞核测序技术（snRandom-seq），该方法可以对FFPE组织进行单细胞基因表达谱分析，通过随机引物可以捕获全长总RNA，此外还能检测到许多长链非编码 RNA（lncRNA）和短链非编码 RNA（sncRNA），包括核仁小RNA（snoRNA）、核小RNA（snRNA）和microRNA（miRNA），这表明snRandom-seq能够进行全转录组分析。此外，还有两种FFPE单细胞RNA测序方法：snPATHO-seq和snFFPE-seq，也都是基于分离单个细胞核来实现的。目前可以分析FFPE样本的空间转录组学技术已经商业化，例如10x Genomics的FFPE版Visium和Visium CytAssist。此外，来自10x Genomics的Xenium In Situ和NanoString的SMI可以实现单细胞分辨率的FFPE组织样本空间基因表达谱分析。因此，FFPE组织的RNA表达可以通过单细胞和空间技术进行强大的结合分析。在多组学时代，鉴于Arc-well高通量单细胞基因组分析成功的经验，其他类型的FFPE样本组学分析也许是可行的（图1）。例如，ATAC-seq现在已广泛用于新鲜样品单细胞分析，并被证明同样适用于FFPE样本。因此，为FFPE样本开发单细胞ATAC-seq也具有潜在的可行性。然而对于其它表观遗传组分析，比如DNA甲基化检测，由于福尔马林固定引起的核苷酸的不可逆损伤而使其更具挑战性。此外，FFPE样本的代谢组学分析已经被证明在空间水平上是可行的，未来有望达到单细胞甚至亚细胞的分辨率。充分地利用现有的标本进行回顾性实验对于推进生物医学的时效性研究具有深远意义。因此，在找到一种新的样本保存方法之前，我们需要克服技术阻碍，最大限度地提高FFPE组织的数据采集，开发更准确的数据过滤算法，以便更好地利用FFPE样本。

总结与展望

本文针对Arc-well技术进行了评述，指出了其应用范围和局限性，以及其对基础研究和技术发展的潜在影响。该技术适用于FFPE组织的高通量单细胞基因组和转录组测序技术的成功开发，为其它单细胞多组学技术（表观遗传组，蛋白质组，代谢组等）的研发带来新希望。未来多组学技术的发展，有望使科研人员能更全面地绘制健康和患病人群的组织、细胞，甚至分子图谱，促进我们对癌症及其他疾病的机制研究。接下来我们需要做的是建立一个完整的、适用于FFPE组织的单细胞和空间组学分析工具包，这将为癌症和其他疾病的回顾性研究、诊断和治疗提供强大的支撑。

责任编辑

林昶东  同济大学

赵柏林  西安交通大学

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原文链接：https://www.the-innovation.org/article/doi/10.59717/j.xinn-life.2023.100034

本文内容来自The Innovation姊妹刊The Innovation Life第1卷第3期以Commentary发表的“High-throughput single-cell genomic analysis for archival tissue blocks” (投稿: 2023-08-28；接收: 2023-10-05；在线刊出: 2023-11-21)。

DOI: https://doi.org/10.59717/j.xinn-life.2023.100034

引用格式：Zhu L. and Ke R. (2023). High-throughput single-cell genomic analysis for archival tissue blocks. The Innovation Life 1(3), 100034.

作者简介

柯荣秦，华侨大学医学院教授，长期致力于分子诊断学技术方法的开发和应用研究，入选国家级青年人才项目，福建省“百人计划”，福建省“闽江学者”特聘教授，厦门市首批杰出青年人才及“双百计划”领军型创业人才。曾就职于美国Complete Genomics公司，发明了基于DNA纳米球的双端测序技术，现为华大基因自主研发的国产二代测序系统的核心技术之一。共同发明了RNA原位测序技术，该技术入选了Nature Methods杂志2013年度的年度方法专题的“Methods to Watch”并引领了基于成像的空间转录组学技术的发展。先后主持或参与国家自然科学基金、国家重点研发计划、福建省自然科学基金等国家级和省部级项目。

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