侵袭性真菌病真菌学检查指南 2023
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本指南主要包括适应证、样本、检测技术、结果解释和会诊等内容，目的是析疑解难、促进学科发展，为临床诊疗防控等提供专业帮助，为患者治病康复提供可靠服务。
一、适应证
1.念珠菌菌血症和其他念珠菌感染：
推荐对有临床特征（持续发热、规范抗细菌治疗无效）同时合并风险因素（抗菌药物的使用、持续粒细胞缺乏、实体器官或干细胞移植、置入导管、全肠外营养、腹腔手术、胰腺炎、糖皮质激素、其他免疫抑制剂的使用等）患者进行相关样本的念珠菌镜检和培养等检查［4］（强，中）。
下呼吸道样本直接镜检和分离培养出的念珠菌无法区分定植与感染，临床意义有限，常规不推荐进行鉴定和药敏试验［5］（强，低）。
一旦确定念珠菌菌血症的诊断，推荐规律复查血培养，直到至少连续两次血培养结果阴性［5］（强，中）。
推荐进行真菌的（1，3）-β-D葡聚糖检测（G实验）（强，中），感染早期G实验即可呈阳性，阴性预测值（negative predictive value，NPV）较高［7］。
与常规血培养相比，该检查具有更高的敏感度，特异度为90%［8］。
临床可考虑常规开展念珠菌对唑类药物的敏感试验，耐药菌感染史、耐药菌高流行区、迁延不愈者，尤其应该进行敏感试验［9, 10］（弱，低）。
近期有棘白菌素暴露史；近平滑念珠菌、光滑念珠菌、耳念珠菌所致感染需要用药；抗真菌治疗超过1周仍能分离出致病念珠菌［9，11］（强，低）。
2.曲霉病：
推荐对具有侵袭性曲霉病（invasive aspergillosis，IA）风险因素或怀疑IA的患者进行相关样本的镜检与培养 ［12］（强，中）。
IA风险因素包括：血液系统恶性肿瘤、慢性肺部疾病、移植（实体和骨髓）、糖皮质激素治疗、中性粒细胞缺乏和慢性肝病，也包括使用免疫抑制剂、结构性肺病和肺部血管疾病、入住ICU、老年等。
急性呼吸衰竭的新型冠状病毒感染（COVID-19）患者，特别是有创通气时，使用糖皮质激素或托珠单抗治疗时，尤其需要注意COVID-19相关肺曲霉病（COVID-19-associated pulmonary aspergillosis，CAPA）。
支气管肺泡灌洗液（BALF）中曲霉培养阳性时，推荐结合临床表现和影像学有意义特征，考虑诊断为感染而非定植［14］（强，中）。
怀疑IA时，推荐采集组织活检样本，可应用六胺银染色和过碘酸雪夫染色识别真菌形态和结构［15, 16］（强，中）。
治疗失败时，推荐进行药敏检测［17, 18, 19, 20］（强，中）。
建议G实验用于免疫抑制的重症患者IA的诊断和筛查［24, 25］（强，中）。
推荐血清GM用于IA患者治疗效果的监测［31］（弱，中），但不建议其用于已使用预防性抗真菌治疗的无症状患者的监测和筛查［32］（弱，中）。
对于非粒细胞缺乏患者，推荐对BALF进行GM检测，用于诊断IA［33, 34, 35］（强，高）。
曲霉IgG抗体在曲霉结节中的诊断价值缺乏文献报道。
推荐连续2次，或2个及以上样本检测［40, 41, 42］。
血液样本曲霉PCR可用于血液系统恶性肿瘤的IA诊断［43］（强，中）。
3.肺毛霉感染/毛霉病：
已有基础疾病的患者发生发热伴咯血或其他呼吸道表现、且进展迅速，肺部CT提示局灶性实变、包块、胸腔积液或多发结节或“真菌感染可能”，推荐进行痰液、BALF、组织活检（针吸或切片）的真菌染色和培养检查［44, 45, 46, 47, 48, 49］（强，高）。
糖尿病（尤其是酮症酸中毒，或控制不佳）、中性粒细胞缺乏、实体器官移植和造血干细胞移植受者、恶性肿瘤、铁过载、脓毒症、HIV感染等。
各种原因导致免疫功能低下、外伤、使用广谱抗细菌药物、孢子环境暴露等。
罹患COVID-19时，血液病与实体器官移植、使用免疫抑制剂、粒细胞减少、糖尿病控制不佳、使用糖皮质激素，须注意COVID-19相关毛霉病（COVID-19-associated mucormycosis，CAM）。
糖尿病（尤其是酮症酸中毒）患者发生发热伴或不伴鼻溃疡或坏死、眶周或面部肿胀、视力减退、眼肌麻痹、鼻窦炎、头痛、神志改变，需立即进行相应部位分泌物或组织（针吸或切片）的真菌染色镜检和培养［45, 46, 47, 48, 49, 50］（强，高）。
4.耶氏肺胞子菌肺炎（PJP）/肺孢子菌感染：
HIV感染者出现肺炎，亚急性起病，出现发热、干咳、进行性呼吸困难和低氧血症等临床表现，肺CT显示双侧多发弥漫性间质改变，累及肺门周围区域的双侧肺间质病变和肺泡浸润，双侧弥漫性毛玻璃样改变，推荐进行PJP病原学检测［50, 51, 52, 53］（强，中）。
PJP的风险因素包括：艾滋病、癌症、伴有器官移植（尤其是肾移植）的医源性免疫抑制、自身免疫性和炎症性疾病、肾病综合征等。
检查方法包括特殊染色（如六胺银染色）、分子生物学检查（如PCR）、G实验和乳酸脱氢酶（lactic dehydrogenase，LDH）。后两者NPV较高，美国移植学会强调G实验及LDH同时阴性对PJP有较高的NPV。
非HIV感染的免疫缺陷患者（包括血液系统恶性肿瘤、实体瘤、器官移植、自身免疫性疾病、接受化疗药物、免疫抑制剂或生物治疗）出现肺炎，急性起病，出现发热、干咳、呼吸困难、低氧血症，肺CT显示肺间质纹理增强，双侧磨玻璃样改变，伴片状实变，推荐进行PJP的镜检和核酸检测［50, 51, 52, 53］（强，中）。
不推荐采用肺孢子菌的PCR结果和血清G实验进行疗效评价［54］（强，中）。
PJP发生医院感染暴发时，建议对该病区患者（包括免疫抑制患者及免疫正常者）进行呼吸道样本耶氏肺孢子菌筛查，包括基因型别的筛查［51，55, 56］（弱，低）。
5.肺隐球菌病和隐球菌脑膜炎：
有肺部症状且有胸腔积液时，推荐进行隐球菌抗原（cryptococcus antigen，CrAg）检测［57, 58, 59, 60］（强，高）。
免疫功能低下的患者（如HIV/AIDS、淋巴瘤、实体肿瘤、长期服用糖皮质激素等）出现头痛、精神错乱、视力和听力障碍等中枢神经系统的症状，高度怀疑为隐球菌脑膜炎时，推荐进行脑脊液隐球菌培养、脑脊液墨汁染色、脑脊液CrAg检测等［57, 58, 59, 60, 61］（强，高）。
影像学检查（特别是肺部及颅内）发现异常，而怀疑隐球菌病的患者，推荐进行血培养、血清隐球菌CrAg检测［57，59，62, 63］（强，中）。
不推荐对隐球菌感染患者常规进行抗真菌药敏试验。
（1）与氟康唑最低抑菌浓度（MIC）增加相关的格特隐球菌感染者；（2）初始治疗失败或复发的新型隐球菌感染者；（3）近期有抗真菌药物暴露（如氟康唑预防使用）的隐球菌感染者；（4）无法准确区分新型隐球菌和格特隐球菌时（强，中）。
6.马尔尼菲篮状菌感染：
怀疑马尔尼菲篮状菌感染时，推荐采集感染部位样本进行真菌涂片镜检、培养、PCR或宏基因组下一代测序技术（mNGS）等方法检测（强，低）。
可以考虑外周血液和骨髓样本。HIV阳性患者感染马尔尼菲篮状菌常表现为播散性感染，侵犯多个器官。
马尔尼菲篮状菌侵袭性感染的风险因素包括：急危重症和免疫功能低下者，如艾滋病患者（风险因素是CD4计数低）、癌症或器官移植患者。
对于局部感染为主要表现，考虑为该菌感染的患者，推荐采集感染部位的样本进行真菌培养、涂片镜检、PCR或mNGS方法检测［4，64, 65］（强，低）。
对于疑似肺部马尔尼菲篮状菌感染患者，推荐采集痰液、BALF、肺病变部位细针抽吸物或肺活检切片进行染色镜检、培养、PCR或mNGS方法检测（强，低）。
首发症状在皮肤，且考虑皮肤马尔尼菲篮状菌感染时，或确诊了皮肤马尔尼菲篮状菌感染时，除皮损部位分泌物或皮肤活检外，建议进行系统性判断，看是否播散性感染（弱，低）。
7.镰刀菌感染：
当免疫缺陷人群发生肺部、皮肤等部位的感染、且对经验性抗菌治疗没有反应时，需要检测是否存在镰刀菌感染，推荐采集感染部位的样本进行真菌涂片镜检、真菌培养、PCR或mNGS方法检测（强，低）。
侵袭性镰刀菌感染的风险因素包括急性髓系白血病、异体造血干细胞移植、巨细胞病毒再激活和基线时镰刀菌阳性皮损的存在。
少数情况下，镰刀菌感染的患者可能表现为单一器官受损伤，如关节炎和鼻窦炎，或导管相关真菌血症［4，66］。
推荐采集关节穿刺液、鼻窦吸出物等感染部位的样本进行涂片染色镜检、培养、PCR或mNGS方法检测（强，低）。
8.赛多孢感染和多育节荚孢霉感染：
多育节荚孢霉更为致命，死亡率高达77%。
赛多孢感染病例在世界各地均有报道，从局部感染到播散性疾病不等。
赛多孢感染的风险因素包括恶性肿瘤、实体器官移植、溺水和雪崩等，可以引起各个部位感染，没有具体器官的嗜好性。
多育节荚孢霉可引起院内感染。
对于疑似赛多孢感染引起的足菌肿的患者，推荐采集皮损部位分泌物或皮肤活检进行染色镜检、培养、PCR或mNGS方法检测（强，低）。
疑似赛多孢引起软组织和手术伤口感染、关节炎和骨髓炎、耳真菌病、鼻窦炎、支气管过敏、眼部感染、血管假体感染、心内膜炎和播散性感染、中枢神经系统感染时［66, 67, 68］，推荐采集感染部位的样本进行真菌培养、涂片镜检、PCR或mNGS方法检测（强，低）。
对于溺水、雪崩患者，高度怀疑赛多孢引起肺部感染时，推荐采集BALF、胸腔积液、肺病变部位细针抽吸物或肺活检切片进行染色镜检、培养、PCR或mNGS方法检测（强，低）。
二、样本
重视微生物学样本的采集和送检对于诊断IFD非常重要［69］。
相对于细菌、病毒感染，真菌感染样本采集具有一定的特殊性。
表2汇总了常见真菌在不同系统感染中的采集要求和策略。
对于临床疑似真菌感染的患者，推荐先采集微生物样本送检，再使用抗真菌药物进行治疗［70］（强，低）。
推荐从无菌部位采集样本；从有菌部位采集样本时，应尽可能减少正常菌群的干扰［64，71］（强，低）。
推荐真菌样本送检前填写真菌检验申请单，申请单除常规内容外，建议添加真菌感染的风险因素、真菌感染的症状和体征、生物标记物［如：C反应蛋白（CRP）、降钙素原（PCT）、GM、G实验等］结果等［63］（弱，低）。
1.血液：
包括：血流感染（考虑酵母样真菌、丝状真菌和双相真菌）、导管相关性血流感染（考虑酵母样真菌）、心包炎和心肌炎、免疫受损患者会厌炎和声门上炎（考虑曲霉、其他丝状真菌）、免疫受损患者肺部感染（考虑镰刀菌属、荚膜组织胞浆菌）、烧伤创面感染（考虑念珠菌、曲霉、镰刀菌、链格孢、毛霉目）、手术部位感染（考虑念珠菌）、皮肤和皮下组织真菌感染（考虑申克孢子丝菌、地霉、马拉色菌、毛霉目）、自体瓣膜心内膜炎且患者吸毒或有严重基础性疾病；人工瓣膜心内膜炎；新型隐球菌脑膜炎或肺炎［66，71］（强，中）。
成人进行血培养后，如果病情持续或加重而临床始终不能除外菌血症，且首次血培养48~72 h阴性，建议隔1~2 d后重复进行1~2次血培养，每次2套4瓶［70］（强，中）。
2.骨髓：
推荐骨髓穿刺首选解剖部位是髂后嵴。如果患者不能活动，可以使用髂前嵴。婴儿可使用胫骨内侧表面［67］（强，低）。
3.呼吸道样本（痰液、BALF等）：
推荐刷牙漱口后采集自气管深部咳出的晨痰，体积≥0.5 ml。
推荐挑取含脓液、血液、黏液的部分进行镜检及培养［64］（强，低）。
怀疑曲霉感染时，建议进行大体积的未处理痰液和BALF培养［68］（弱，低）。
对于疑似真菌感染患者，收集BALF样本时应不添加任何固定液，立即送检，不推荐冷藏样本择期送检（弱，低）。
推荐用BALF检测GM以诊断是否为侵袭性真菌感染［72］（弱，中）。
4.脑脊液：
注意脑脊液采集的适应证（如考虑中枢神经系统感染，不除外真菌病原的情况）、禁忌证（如颅内高压）。
墨汁染色、隐球菌荚膜抗原检测等是急查项目，采集后推荐立即送检，实验室接到后立即处理、报告。
脑脊液涂片、培养等阳性结果按照危急值进行处理［58，61］（强，中）。
5.眼部样本：
采集样本时若病变处分泌物过多，先用无菌湿棉签去除分泌物再选取病变处样本，立即送检。
常温保存不超过 2 h（强，低）。
直接显微镜检查有助于结膜炎的初步诊断，推荐采集2根拭子，1根用于培养，另1根用于制备涂片（强，低）。
曲霉属推荐进行KOH涂片镜检，镰刀菌及暗色真菌推荐进行真菌培养，若发现真菌成分并结合临床症状可确诊侵袭性真菌感染［71］（强，高）。
6.穿刺液（胸腔积液和腹腔积液）：
对于念珠菌性腹膜炎患者，建议早期进行腹腔积液样本培养。
推荐手术或经皮穿刺收集的坏死或化脓性样本作为念珠菌腹膜炎微生物学诊断的样本，当怀疑有念珠菌时，推荐收集至少1 ml腹腔液体或1 g组织接种到培养基［73］（强，高）。
对于继发于肺隐球菌感染的胸腔积液，推荐在真菌培养阴性时，检测样本中的新型隐球菌荚膜抗原［74］（强，高）。
推荐在没有分子诊断资源的地区，采集足量组织样本以同时进行组织病理学和真菌涂片镜检、培养以诊断真菌感染［75］（强，高）。
对于COVID-19相关的肺毛霉病（COVID-19 associated pulmonary mucormycosis，CAPM），建议进行经胸穿刺活检，以诊断外周胸部病变患者的CAPM［76］（弱，中）。
7.鼻窦样本：
推荐采集感染部位2~3块的组织或抽吸物送检（强，低）。
当真菌侵袭鼻窦部引起慢性鼻窦炎时，建议样本仅从鼻腔较大的一侧收集并在 24 h内送往真菌学实验室［77］（弱，低）。
三、检验技术
四、会诊
非无菌样本如果培养阳性或其他检查结果阳性，但不具备临床表现和影像学特征，考虑为定植（弱，低）。
1.侵袭性念珠菌病：
血液、其他深部组织样本和无菌体液（24 h内的手术部位样本和/或引流液）微生物学涂片检查和/或组织病理学检查发现念珠菌可以确诊（强，高）。
非培养方法（G实验、念珠菌抗原和抗体检测、PCR检测等）可作为极似诊断的微生物学证据，结合患者临床严重程度、风险因素可形成极似诊断［111, 112］（强，中）。
非无菌部位的样本发现念珠菌通常是定植状态，不能单独用于相应样本部位的侵袭性感染的确诊或极似诊断，但是如果有多部位定植（指同时在2个或2个以上部位分离出念珠菌，即使菌种不同）或某一部位持续定植（指每周至少2次非连续培养阳性）可作为IC的风险因素（弱，低）。
对COVID-19患者早期评估CAC，念珠菌评分可能没有意义（弱，低）。
会诊最佳策略是通过评估临床风险因素和定植状态，结合非培养方法结果，考虑IC极似诊断的可能性，及早启动抗真菌治疗。
经验性治疗首选棘白菌素（强，高）。
非重症无氟康唑暴露患者也可选择氟康唑治疗（强，高）。
经验性抗真菌治疗4~5 d症状无改善，在启动经验性治疗后没有发现侵袭性念珠菌感染证据，或非培养方法阴性且具有较高的NPV，建议停止抗真菌治疗（强，低）。
推荐每天或隔天进行随访血培养，确认念珠菌是否清除，从而评估抗真菌治疗的疗程，在确认培养阴性、病原菌清除后再继续用药14 d（强，中）。
耳念珠菌对三唑类及两性霉素B耐药率高，推荐经验性治疗首选棘白菌素类；对中枢神经系统或者尿路感染，推荐两性霉素B，或者同时联合氟胞嘧啶（弱，低）。
IC的预防用药推荐氟康唑（强，高）。
明确念珠菌菌血症诊断后，会诊时应指导迁徙部位的评估，重点包括眼底检查以排除眼内炎，完善肝脏、肾脏CT以排除感染，腰椎穿刺脑脊液进行培养等检查以排除中枢神经系统感染（强，高）。
目标性治疗无效，往往没有充分评估感染迁徙部位，感染灶没有彻底清除，选择的抗真菌药物在感染灶分布浓度低，比如中枢和肾脏感染，棘白菌素类不能到达，需要联合其他种类的敏感抗真菌药物，或需要外科干预去除感染灶。
2.隐球菌病：
血液、其他深部组织样本和无菌体液（脑脊液等）涂片墨汁染色阳性、培养阳性和/或组织病理发现隐球菌可以确诊。
脑脊液、血液的隐球菌荚膜抗原检测阳性也可作为隐球菌病的确诊证据（强，高）。
痰液、BALF等隐球菌可定植部位样本培养出隐球菌不可作为确诊指标，但可作为肺隐球菌病极似诊断的微生物学证据。
非培养方法PCR等分子诊断方法也可作为极似诊断的微生物学证据（强，高）。
非侵袭性隐球菌病首选氟康唑治疗，重症播散性感染推荐应用两性霉素B脂质体联合5-氟胞嘧啶强化治疗，巩固期选用氟康唑治疗［113］（强，高）。
伏立康唑和泊沙康唑用于补救治疗，而棘白菌素类（阿尼芬净、卡泊芬净和米卡芬净）对隐球菌没有体内活性。
另外，如果菌株对氟康唑的MIC≥16 mg/L或氟胞嘧啶≥32 mg/L，要考虑耐药，更换药物。
已经使用过唑类药物者，单独增加唑类药物剂量通常无效，不予推荐。
脑脊液的培养、墨汁染色以及血清抗原滴度的连续监测不是治疗反应的可靠指标，疗效需要临床综合评估。
3.曲霉病：
无菌样本真菌涂片和培养发现曲霉，或组织病理发现曲霉是确诊标准（强，高）。
COVID-19相关曲霉病：尚无诊断的金标准，建议参考ECMM和国际人与动物真菌学会共识定义［114］（弱，低）。
呼吸道样本（痰液、气道吸出物和BALF）培养出曲霉往往很难除外污染和气道定植，但是直接镜检发现曲霉菌丝临床意义大，可以指导临床开始经验性抗真菌治疗（强，中）。
如果培养阳性，需要结合涂片结果，单独培养阳性需要结合患者的风险因素和影像学特征作出肺曲霉病的极似诊断（强，中）。
非培养方法包括GM试验（血液、BALF和脑脊液）和PCR检测可以作为极似诊断的微生物学证据（强，中）。
肺曲霉病患者优选BALF的GM试验，该试验可以帮助区分培养阳性是定植还是感染（强，高）。
对于正在进行曲霉病预防治疗的患者，诊断突破性侵袭性感染，血清GM试验敏感性低，容易导致假阴性，但是BALF的GM试验有临床意义，可以单独或联合PCR检测协助诊断新的突破性感染（强，低）。
其他新型三唑类抗真菌药，如艾沙康唑也可作为一线治疗药物，特别是在严重和长期免疫抑制，不能除外合并其他真菌时（强，高）。
脂质体两性霉素B可作为三唑类不耐受者的替代治疗（弱，中）。
棘白菌素类可考虑作为伏立康唑、艾沙康唑之后的二线治疗或挽救性治疗（弱，中）。
GM试验的结果变化可用于临床疗效评估（弱，中）。
三唑类预防治疗发生突破性感染时，推荐应用脂质体两性霉素B（强，高）。
如果脂质体两性霉素B治疗时出现突破性感染，推荐改用伏立康唑或艾沙康唑（强，高）。
曲霉特异性IgG水平升高可以是慢性曲霉病极似诊断的微生物学证据，曲霉特异性IgE水平升高可以作为变应性支气管肺曲霉病诊断的微生物证据［75，115］（强，高）。
4.肺孢子菌肺炎：
通过组织、BALF、痰液以及诱导痰的常规六胺银染色镜检，发现肺孢子菌特征性微观结构如包囊或滋养体可作为PCP的确诊证据（强，高）。
核酸检测（PCR、mNGS等）方法阳性，需要除外定植状态，结合患者风险因素和影像学特征可以作为极似诊断的微生物学证据，从而开始早期的治疗（弱，中）。
G 试验也可作为极似诊断的微生物学证据，但其升高程度与病情严重程度无相关性（强，中）。
美国移植学会强调G实验及LDH同时阴性对PJP有较高的NPV。
推荐免疫抑制患者应以预防为主，尤其是有定植的患者。
因肾脏功能受损，限制了磺胺药物的足量应用而影响疗效，可以联合卡泊芬净以达到较好的治疗效果（弱，低）。
5.毛霉病：
从感染部位获得的无菌样本（手术、内镜或CT引导下穿刺组织）涂片镜检、培养或组织病理发现典型的特征可以确诊（强，高）。
COVID-19确诊后，建议关注CAM。
鼻眶脑毛霉病患者的鼻腔样本、肺毛霉病的BALF、痰液样本，若涂片和培养发现典型的毛霉特征可以为极似诊断提供微生物学证据（强，高）。
核酸检测（PCR、mNGS等）方法也可以提供极似诊断的微生物学证据（弱，低）。
GM和G实验可用于其他真菌的鉴别诊断或混合感染（弱，中）。
对确诊或极似诊断毛霉病的患者，推荐紧急启动临床处置，使用两性霉素B脂质体进行一线抗真菌治疗，备选方案为艾沙康唑或泊沙康唑（强，高）。
除了系统性抗真菌治疗外，推荐尽早进行外科手术治疗［44］（强，高）。
推荐严格控制血糖，并优化糖皮质激素的使用（强，低）。
6.其他深部真菌病：
包括马尔尼菲篮状菌、镰刀菌、赛多孢以及地方性真菌病等。
确诊标准是血液、其他深部组织样本和无菌体液涂片、培养阳性或组织病理发现典型的真菌结构（强，高）。
mNGS检测可以作为极似诊断的微生物学证据（弱，低）。
侵袭性感染的治疗：马尔尼菲篮状菌推荐两性霉素B诱导治疗+伊曲康唑巩固治疗的序贯疗法；镰刀菌推荐两性霉素B脂质体治疗，备选是伏立康唑、泊沙康唑；赛多孢推荐伏立康唑治疗，必要时考虑手术干预（强，高）。
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引用：中国医疗保健国际交流促进会临床微生物学分会, 中华医学会检验医学分会临床微生物学组, 中华医学会微生物学和免疫学分会微生物学组. 侵袭性真菌病真菌学检查指南[J]. 中华检验医学杂志, 2023, 46(6): 541-557.