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空间单细胞DNA测序

生信技能树 单细胞天地 2022-06-07

呐,等你关注都等出蜘蛛网了~


不知不觉在单细胞转录组领域做知识分析也快两年了,很幸运聚集了五个小伙伴携手共进,我们承诺不间断更新5个月,把我们这两年的学习成果全部掏出来给大家,包括5个栏目:

  1. 文献速递(简短介绍,扩充知识面)

  2. 文献详解(图文并茂带来大家系统性学习)

  3. ř与Bioconductor的技巧(书籍翻译,妙招共享)

  4. scRNAseq的GitHub的书籍翻译(原汁原味的名校教程)

  5. 全网第一个单细胞转录组视频教程学习笔记分享

希望大家能有所收获!


现在你看到的是文献速递


背景知识


需要仔细查询以下名词的意思:


  • Ductal Carcinoma in situ (DCIS)

  • Invasive ductal cancer (IDC)

  • DCIS-IDC patients

  • Topographic Single Cell Sequencing (TSCS)

  • the independent lineage model

  • the evolutionary bottleneck model

  • laser-capture microdissection (LCM)

  • whole-genome amplification (WGA)

  • degenerative oligonucleotide PCR (DOP-PCR)

  • single-nucleus sequencing (SNS)

  • Shannon(clonal) diversity



 

空间单细胞DNA测序技术:Topographic Single Cell Sequencing 发表于2018年CELL杂志,文章题目是:Multiclonal Invasion in Breast Tumors Identified by Topographic Single Cell Sequencing 非常值得精读。



DCIS-IDC的乳腺癌病人的发病区域有3种细胞: normal stromal cells, in situ ducts, invasive cells,后面就是分析这3种细胞的区别。

DCIS病人并不一定会发展成为IDC,这一过程机制不明朗,值得探索。难点在于肿瘤异质性,而且stromal太多,肿瘤细胞太少。

单细胞DNA测序技术很强大,但常规的建库技术都需要细胞悬浮过程,比如 fluorescence-activated cell sorting (FACS),micromanipulation,microdroplets,or nanowells,这样就失去了测序的细胞原来的位置信息,而这个位置信息在研究早期癌症发生进化过程非常重要,所以作者结合了laser-capture microdissection (LCM), laser catapulting, whole-genome amplification (WGA), and single-cell DNA sequencing这4个技术,创造性的开发了Topographic Single Cell Sequencing (TSCS) 技术,并且在10个DCIS-IDC的乳腺癌病人上面应用了,结果表明癌症发生是单一起源,但是在侵袭过程中是多克隆的。


技术流程

如下图



一图胜千言,很容易看明白这个流程,就是先对组织样品进行染色,这样可以区分3种细胞,然后利用LCM技术来挑选微小区域的细胞,再利用laser catapulting精准的挑选一个单细胞去建库测序,单细胞的DNA扩增采取的是DOP-PCR技术,最后进行数据分析,找CNV情况,跟原来的空间位置信息进行关联。


8号病人概况

如下图



如上图所示,对8号病人,作者从4个病变区域进行采样,总共分析了85 in situ cells and 150 invasive cells,分析测序数据的CNV,使用1-dimensional clustering可以把这些细胞分成4组,其中一组是没有拷贝数变异的二倍体正常细胞。肿瘤细胞成“A,” “B,” and “C” 这3个亚克隆。使用TimeScape可以分析这些细胞的进化情况。使用multi-dimensional scaling (MDS)分析也得到同样的结果,分成4组,而且可以看到in situ cells 和invasive cells是无法被区分开来的。可以看到3个克隆都起源于ducts,然后A克隆在invasive cells的比例远少于in situ cells ,它的侵袭能力不及B,C克隆。因为B,C克隆部分肿瘤细胞有着EGFR的扩展,这被认为是侵袭能力的象征。


4号病人概况

如下图



如上图所示,对4号病人,作者在2额病变区域采用,共分析了46 in situ cells and 58 invasive cells 单细胞DNA测序数据。这个时候分析拷贝数变异得到的是2个肿瘤亚克隆,且都起源于ducts,在侵袭的过程中,B克隆由16% 增长到 67%,但是A克隆由84% 减少到 33%。


10个病人整合分析拷贝数变异的进化情况

如下图



对10个病人综合起来总共测了 425 in situ and 503 invasive 和365 stromal diploid cells,这些单细胞DNA测序数据都是可以从SRA数据库里面下载的。可以看到所有病人的亚克隆都不多,在1~5个之间。比较奇怪的是有4个病人都是单克隆,或者说仅仅是从单细胞DNA测序得到的拷贝数变异无法区分不同的克隆。

即使对于有着多克隆的那些病人来说,并不是所有的克隆在in situ 和 invasive 的比例都发生了变化,说明只有部分克隆是具有高侵袭能力的。


肿瘤病人的亚克隆和空间信息的对应

如下图



只有6个病人是有着多克隆的,可以看到所以的克隆都会在 in situ and invasive 区域出现,只是不同的克隆在不同的区域的比例不一样,说明这些克隆起源是单一的,但是侵袭是同步的,取决于各自的侵袭能力。


3种细胞的外显子测序结果分析

前面背景介绍过DCIS-IDC的乳腺癌病人的发病区域有3种细胞: normal stromal cells, in situ ducts, invasive cells,作者对这10个病人的3种细胞用 laser-capture microdissection (LCM)技术取1000个左右的细胞进行全外显子测序,并且分析somatic mutation情况。

如下图



大部分的乳腺癌相关基因,比如TP53PIK3CANCOA2ABL2PDE4DIPAHNAK 都是在ducts和invasive区域都出现了,值得注意的就是 in situ specific (n = 12) or invasive specific (n = 11) in 4 patients (P3, P4, P7, and P8) 这些位点,但是普通的WES技术限制。

所以作者对12个 in situ-specific 的突变进行了45万X的超高深度测序,发现8个的确是真正的 in situ-specific ,另外4个是WES测序技术限制。但是这8个变异并不像是在侵袭过程中起着关键作用,作者并没有解释这是为什么。但是却说另外4个变异里面的MMP8很重要,因为它在ducts的时候频率很低,到了invasion区域就升高了很多,它应该是那些侵袭相关基因。


看MAF变化情况

这里作者重点分析 mutation frequency的变化情况

如下图



作者就关心那些突变频率发生显著提升的基因,就是 large (>0.5) mutation-frequency changes。的确是发现了7个这样的突变。但是作者并没有解释为什么。

作者接着利用WES数据的somatic mutation信息和CNV信息,使用 PyClone 2进行亚克隆推断,发现比前面单细胞的CNV信息推断的要多,作者认为是因为ducts区域的点突变多样性先发生了,还没来得及扩散到invasion区域,所以单细胞的CNV是无法区分的。


还有几个细节我没有仔细介绍,比如TimeScape和 PyClone 2的用法,以及作者提出的多克隆侵袭模型。


数据公布在SRA

  • trace.ncbi.nlm.nih.gov/

  • trace.ddbj.nig.ac.jp/DR

其中NCBI的镜像要方便一点,数据量很大:

  • Experiments:1989

  • Runs:1989 (1.1Tbp; 472.2Gb)

包含着 10 个病人的 norm,ducts,invasive这3个地方的外显子测序数据(~150X),用来找somatic mutation。

还有从这10个病人里面取的1293个单细胞的DOP-PCR测序,这些数据只用来找CNV了。

还有部分基因的超深度测序(~45万X),看mutation frequency的变化情况,研究超低频突变。

节选部分如下:



如何你对单细胞转录组研究感兴趣,但又不知道如何入门,也许你可以关注一下下面的课程

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