肺中单细胞信号交互图谱
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肺的发育和功能来自不同细胞类型和谱系之间的相互作用，文章采用单细胞RNA-seq技术，表征了小鼠发育过程中肺的细胞组成及其分子特征的动态性，反映了一群常驻嗜碱性粒细胞调节肺泡巨噬细胞的发育和功能情况对肺内稳态的控制。该工作分析了来自17只小鼠的10196个CD45-(非免疫)细胞，10904个CD45+（免疫）细胞。
样本(在同一窝小鼠中取样)
胚胎小鼠肺E12.5（取6个样本混合）； E16.5, E18.5 和 E19.5（取2个样本混合）
新生小鼠肺1, 6, 7, 10,16, 30小时；2天和7天
成年小鼠肺（8-12周）
整体流程
建库方法：MARS-seq
主要数据部分
初级处理及过滤
Illumina NextSeq 500 测序，中等测序深度58585reads/cell，用软件HISAT (version 0.1.6) (Kim et al., 2015) 比对小鼠基因组mm9，做demultiplexe、filter，提取UMI用来分离不同转录本，少于500UMIs的细胞会被丢弃，过滤后，50770个单细胞，每个细胞包含平均中位数2483个独特分子。
数据处理和聚类
用Meta-cell pipeline (Giladi et al., 2018) 来提取基因信息并且计算细胞与细胞间相似性，聚类时血红蛋白相关基因被去除。用metric FPgene,mc来注释细胞类型，同时会列出基因差异倍数。
轨迹分析
Slingshot (Street et al., 2017) 做拟时分析。文章数据复杂并且包含许多相互关联的组分和时间点，作者将Slingshot应用于互连细胞类型的子集，将E16.5单核细胞和巨噬细胞II和III归为数据集a，成纤维细胞谱系归为数据集b。对于数据集a，对所有巨噬细胞II-III和具有低相对表达的Ly6c2的单核细胞进行了Slingshot。
相互作用图谱
用已经出版的受体配体配对库(Ramilowski et al., 2015) 来分析相互作用，配体功能分群注释用David GO annotation tool (Huang et al., 2009)
结果
发育过程中肺细胞类型总览
为了理解不同免疫和非免疫细胞类型和状态对肺发育和体内平衡的贡献，作者收集了肺发育的关键时间点的单细胞谱。17只小鼠的10196个CD45-(非免疫)细胞和10904个CD45+（免疫）细胞用MetaCell算法鉴定到了一些十分少见肺细胞类型。下面的二维图显示了免疫和非免疫单细胞分化为不同谱系：22种细胞类型及状态。结果还显示了关键细胞类型特异性标记基因。
不同基因表达情况如下：
肺发育过程中细胞组成和基因表达的动态变化-1
在胚胎发育期间和出生后不久，肺部会因其成熟和突然暴露于空气中的氧气而发生剧烈的环境变化，单细胞RNA-seq数据分析显示细胞组成在这些时间点变化很大。在细胞类型水平，在怀孕期间观察到免疫和非免疫组合物中最突出的细胞动力学。柱状图显示了跨时间点的免疫（CD45 +）和非免疫（CD45）的细胞类型分布。
肺发育过程中细胞组成和基因表达的动态变化-2
图片分别显示从出生0h开始绘制的巨噬细胞组成动态变化，根据以前的结果，作者将巨噬细胞亚群定义为I-III,I主要在怀孕前期出现，II在出生前后出现，III从孕晚期开始稳定增多，在出生后第七条达到峰值。从单核细胞到巨噬细胞II–III的变化轨迹结果显示，巨噬细胞I细胞在转录水平上不同于巨噬细胞亚群II-III。 值得注意的是，巨噬细胞亚群II-III与E16.5单核细胞形成连续的转录谱，表明巨噬细胞II和III从胎肝单核细胞分化而来，而不是来自巨噬细胞亚群I，其可能具有卵黄囊起源。为了推断单核细胞和巨噬细胞亚群最可能的分化轨迹，作者使用Slingshot进行拟时间推断，并从E18.5开始逐渐获得巨噬细胞基因。
肺中嗜碱性粒细胞广泛地与免疫和非免疫区室相互作用
在多细胞生物中，组织功能随着异质细胞类型形成复杂的通信网络而出现，其主要通过配体和受体（LR）之间的相互作用来发挥作用。探索单细胞图谱中的LR对可以揭示重要的细胞组分。作者在所有肺细胞类型直接表征LR对，希望能揭示控制发育的潜在联系。作者基于细胞的相关结构预测了配体和受体，从而得到了所有LR及其相互作用的图形联系。嗜碱性粒细胞包含罕见的免疫区室（1.5％），显示出丰富而复杂的LR谱。 这种相互作用的图突出显示了嗜碱性粒细胞是许多关键细胞因子和生长因子的主要来源。
肺嗜碱性粒细胞的空间和转录特征
抗GFP抗体染色进一步证实嗜碱性粒细胞分布在整个肺叶上。为了在分子层面鉴定肺嗜碱性粒细胞，作者试图通过流式细胞术（CD45 +FceR1α+ cKit-）广泛分离它们。肺嗜碱性粒细胞的基因表达谱与血液循环的嗜碱性粒细胞不同，其特征在于独特的基因特征，包括Il6，Il13，Cxcl2，Tnf，Osm和Ccl4的表达。 此外，这种独特的基因标记持续存在于成人肺部驻留的嗜碱性粒细胞中。 值得注意的是，与其他肺免疫细胞和非免疫细胞相比，配体Il6，Hgf和L1cam仅由肺嗜碱性粒细胞表达。
总结
理解组织发育，体内平衡和疾病中涉及的分子机制十分重要，作者将单细胞RNA-seq分析水平的组织发育动力学与细胞类型之间所有配体 - 受体相互作用的广泛筛选相结合，绘制了所有肺类型的综合细胞网络。嗜碱性粒细胞被认为是短寿命的粒细胞，它们在组织发育和体内平衡中的作用尚不清楚，作者发现肺嗜碱性粒细胞的特征是有许多细胞因子和生长因子的表达，那么这对免疫和非免疫细胞功能至关重要。
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