Trends Cell Biol全面综述：神经退行性疾病中Tau的相分离

微管相关tau蛋白的聚集在阿尔茨海默病和其他几种神经退行性疾病中起着重要作用。最近，一个令人兴奋的消息是发现，与其他一些与神经退行性疾病相关的蛋白质类似，tau有高度倾向是通过液-液相分离(LLPS)机制进行凝聚的。最近Boyko S等研究者在《Trends Cell Biol》期刊发表了一篇题为“Tau liquid-liquid phase separation in neurodegenerative diseases”的综述，讨论了tau在体外发生LLPS的证据，这一反应的分子机制，以及翻译后修饰和致病突变在tau相分离中的作用。此外本文也将探讨有关细胞中tau发生 LLPS的最新研究，以及tau病中LLPS与神经退行性变之间的联系。

Tau是微管相关蛋白，在一系列神经退行性疾病的发病机制中起着关键作用，这些疾病统称为tau病。这些疾病包括阿尔茨海默病(AD)、进行性核上性麻痹(PSP)、皮质基底膜变性(CBD)、嗜银颗粒病、皮克氏病(Pick‘s disease)、某些形式的额颞叶痴呆(FTD)和慢性创伤性脑病(CTE)。所有这些疾病的关键组织病理学特征之一是在大脑中积累了不溶性的胞浆tau包涵体。这些包裹体的主要类型是神经原纤维缠结(NFT)，尽管也可以存在具有不同形态的结构，其通常是由成对的螺旋细丝组成。阿尔茨海默病患者大脑中NFT的丰富程度似乎与疾病的进展有关。然而，在致病过程中也会积累较小的寡聚体，其中一些寡聚体似乎比成熟的细丝更具神经毒性。不考虑特定的形态，tau丝具有淀粉样纤维的特性，通过种子聚合机制自我繁殖，类似于导致传染性海绵状脑病的朊病毒复制所参与的机制。值得注意的是，越来越多的数据表明，与朊病毒类似，tau聚集体可以在结构上以不同的‘菌株’存在，而且这种类似朊病毒复制的机制可能涉及tau聚集体在细胞间以及各个大脑区域间的传播。

tau从微管分离被认为是tau病变的开始，很可能是由于磷酸化和/或去磷酸化速率降低导致的。为了应对压力，磷酸化的游离tau错误地定位并在树突和胞体中积累。尽管参与这一反应链的各个步骤仍然不完全清楚，但这最终导致了蛋白质聚集。

图1：tau的结构

虽然细胞内的空间组织通常围绕着被膜包裹的细胞器，如细胞核、高尔基体或内质网，但细胞质和细胞核内的一些细胞间隔并不被脂双层包围。这种无膜细胞器如P小体、应激动粒、卡哈尔小体或核仁。后一种类型的细胞区隔是由蛋白质和蛋白质-RNA酸复合体的LLPS驱动的，这一现象被越来越多地观察到。这一过程导致大分子高度浓缩的颗粒(或液滴)的形成。最初，蛋白质液滴是高度活跃的，但随着时间的推移，它们的材料特性往往会通过老化的过程发生变化。

虽然激增的证据表明，通过LLPS形成的细胞区隔可能在许多生物和生化过程中发挥关键作用，但这也有不利的一面。事实上，LLPS似乎与一些最具破坏性的神经退行性疾病的发病机制有关，包括肌萎缩侧索硬化症、AD和某些形式的FTD。这首先是由观察到与这些疾病相关的一些蛋白质不仅形成淀粉样纤维，而且还经历LLPS，以及所产生的液滴的性质受到致病突变的影响。自最初观察到这些现象以来，大量的工作激增，并进一步加强了LLPS和神经退行性疾病之间的联系。这篇文章主要聚焦于tau的LLPS，首先描述了体外研究揭示的tau LLPS的机制和这一过程的后果，随后讨论了最近在细胞背景下关于tau缩合的研究，以及LLPS在tau生物学和病理学中可能扮演的潜在角色。

图2：通过液-液相分离形成的蛋白质液滴的物理性质

用在昆虫细胞中表达的磷酸化蛋白(p-tau441)对tau LLPS进行了初步研究，这些研究表明，p-tau441在拥挤剂存在下能够形成液体液滴。一项早期的研究还表明，磷酸化是tau进行LLPS的主要驱动力(如果不是先决条件)，该反应是由静电和疏水相互作用的复杂组合驱动的。然而，随后的一系列报告清楚地表明，细菌表达的非磷酸化全长tau在生理相关条件下也粗粗经历了LLPS。后一种反应被发现高度依赖于缓冲液的离子强度，随着盐浓度的增加，形成液滴的倾向降低。再加上tau液滴对1，6-己二醇的低敏感性，以及tau的低芳香族残基含量及其极化电荷分布，有力表明了全长tau的LLPS在很大程度上是由静电力驱动的，只有少数已知的其他相互作用能促进其他蛋白质的LLPS。对一系列tau敲低变体的研究进一步支持了这一机制，从而得出结论，在生理pH下，全长tau的LLPS在很大程度上是由蛋白质的带负电荷的N-末端和带正电的中间/C-末端结构域之间吸引的分子间静电相互作用驱动的。值得注意的是，据报道，tau LLPS也会在极高浓度(4-5M)的NaCl存在时发生，在那里它是由疏水相互作用驱动的。尽管这与生理学条件相去甚远，但据推测，类似的疏水相互作用可能在tau过度乙酰化时起重要作用，从而消除了许多Lys残基上的正电荷。

tau的内部K18片段也观察到了LLPS，但这种现象仅在高蛋白浓度下出现。生物物理研究发现了K18凝聚中的热点，并揭示了该片段的LLPS与重复序列的KXGS基序内的残基从延伸构象到瞬时β发夹状状态的转变有关，而另一项研究表明该分子总体上是扩张的。尽管它们很有趣，但尚不清楚从非生理性K18片段的研究中得出的教训是否适用于全长tau。事实上，这两种蛋白质的同型缩合机制似乎完全不同，K18的LLPS主要是由疏水作用而不是静电相互作用驱动的。

其中一个最早观察到tau及其片段形成液滴的能力的现象是在RNA存在的情况下进行的异型LLPS(或复合凝聚)。当tau和RNA上的净正负电荷之比分别为1：1时，tau/RNA混合物发生最大化凝聚；当RNA浓度较高时，液滴开始消散。在这种条件下的液滴消失，也可以在RNA与其他蛋白质的混合物中观察到，通常被称为再入相变。在较高的盐浓度下，tau的复合凝聚作用迅速减弱，并且对1，6-己二醇几乎不敏感。因此，似乎类似于同型tau LLPS，复杂凝聚在很大程度上是由静电相互作用驱动的。然而，这些相互作用的分子性质可能是不同的，复杂的凝聚不仅由静电tau-tau相互作用驱动，而且(可能主要是)tau-RNA相互作用驱动。这与在tau-RNA液滴中观察到的比同型液滴更高的微粘度是一致的，这表明在复杂凝聚体中存在更高密度的多价相互作用。此外，在分子聚集器存在下的实验表明，同型和异型tau液滴可能共存，其平衡取决于RNA浓度。

在RNA存在的情况下，关于tau LLPS的发现提出了关于tau对不同类型的RNA的特异性的问题。这一问题已在几份报告中得到讨论，并得出了不同的结论。虽然使用交联方法的早期研究表明hiPSC来源的神经元和HEK293细胞中的tau优先与tRNAs相关[31]，但研究集中在表达tau的HEK293细胞和rTg4510小鼠中的核斑点上，报告了tau聚集体与小的核仁和核仁RNA的优先关联。在另一项研究中，发现寡聚tau物种可以直接或通过其与hnRNPA2B1的相互作用与N6-甲基腺苷(M6A)修饰的RNA结合。显然，这一重要问题需要进一步研究。

Tau缩合也被另一种聚阴离子——肝素强烈地增强。尽管肝素不太可能是tau的生理伙伴，这一观察结果依然具有重要意义，因为这种多阴离子在tau原纤维形成的研究中被广泛用作辅助因子。此外，鉴于过度磷酸化导致tau总电荷由正向负反转，基于分子动力学模拟，最近提出，丰富的正电荷多胺，精胺，可能在细胞内过度磷酸化tau的缩合中发挥重要作用。然而，这种可能性仍有待实验检验。

最后，在体外，tau LLPS已被证明受到某些金属离子、小分子和蛋白质伴侣的调节。锌似乎对在体外促进微摩尔浓度的tau缩合有特别强的作用。尽管细胞中游离锌的浓度通常要低得多，但这一观察结果可能与AD的发病机制有关，因为AD大脑中的锌水平是高度升高的。

疾病相关突变对tau LLPS的影响

MAPT的一些点突变与FTDP-17家族性病例有关。因此，评估这些突变对tau LLPS的影响是非常有意义的。最先提出这一点的研究报告说，具有致病突变的tau441的几个变体(P301L、P301S、ΔK280、A152T)在没有观察到野生型蛋白的LLPS的条件下形成液滴，这表明突变蛋白的LLPS倾向增强可能导致它们的聚集潜力增加。然而，随后使用各种方法的研究表明，所测试的致病tau变异体(P301L、ΔK280和G272V)与野生型蛋白具有基本上相同的饱和浓度和相图。鉴于饱和浓度提供了蛋白质对LLPS内在倾向的客观测量，似乎点突变并不显著影响tau在生理相关缓冲条件下发生缩合的能力。这与tau LLPS的静电相互作用模型是一致的，在该模型中，带负电荷的N末端和带正电荷的中间/C末端区域之间的分子内吸引静电相互作用涉及大量残基，因此，点突变的影响应该是最小的。

翻译后修饰(PTMs)作为tau LLPS调节因子

Tau经历了大量的PTMs，其中至少有一些似乎对LLPS有调控作用。这可能是由于它们对蛋白质电荷、其构象、与其他大分子的相互作用或这些因素的综合影响。可以说，tau PTMs中最重要的是磷酸化。开始就有断言说磷酸化是tau LLPS的先决条件，尽管这还没有在随后的研究中得到证实，但有相当多的证据表明磷酸化可能调节这一过程和/或其功能后果。这从引入仿磷取代后全长tau的LLPS倾向或引入Mark2的磷酸化后K18的倾向以及观察到磷酸化可以调节tau缩合物中微管的组装(见后文)来表明。鉴于静电相互作用在全长tau的LLPS中的重要性，磷酸化的调节作用很可能强烈依赖于不同激酶磷酸化位点的一致性，因为这将影响极化电荷分布的程度。然而，这一假定的调控机制的分子细节仍在很大程度上未被探索。

Tau的另一个重要的PTM是丰富的Lys残基的乙酰化。由于乙酰化消除了Lys残基上的正电荷，人们预计它会降低tau在RNA存在下经历异型LLPS的倾向，而这种效应确实已经在K18中观察到。乙酰化也被证明抑制了全长tau的同型LLPS，这可能是由于极化电荷分布的破坏和由此导致的分子间静电相互作用的减弱。

LLPS在微管形成中的作用

神经元中的tau与微管相关，并在它们的组装过程中起着重要作用。然而，对于微管束是如何形成的，以及推动这一过程的局部成核机制，我们仍不清楚。因此，也不奇怪其一最早观察到的tau LLPS是在研究微管蛋白束形成机制的背景下进行的。研究发现，在拥挤剂的存在下，微管蛋白的α/β二聚体被分隔成tau液滴，微管蛋白的局部浓度比外部液滴的浓度有较大的提高。几分钟内，凝聚相中的微管蛋白开始聚合成稳定的微管束，最终形成一个非常致密的网络，包裹微管的tau分子保持液体状态。随后的一项研究表明，磷酸化可能在tau液滴内的微管束组装中发挥调节作用，这种影响的程度取决于特定的磷酸化位点。一项研究揭示了tau-微管相互作用的另一个方面，该研究表明，事实上，在没有微管的情况下，募集到微管表面的tau LLPS的浓度可能远远低于其饱和浓度。在体外和神经元中都观察了到这一效应，尽管表面诱导的神经元凝集物的液体状特征尚未得到直接证实。

LLPS在tau聚集中的调节作用

对其他倾向发生LLPS的蛋白的研究表明，液滴的性质随着时间的推移而变化，这一过程通常被称为液滴老化。对于某些蛋白质，这个老化过程的最后阶段是形成淀粉样原纤维网络。因此，鉴于AD和其他tau病的特点是细胞内tau丝的聚集，因此确定LLPS对tau聚集特性的影响是非常有意义的。

最先探索这种关系的研究报告说，由昆虫细胞表达的磷酸化tau(p-tau441)形成的液滴很快失去了最初的动力学特性，在长时间孵育后，液滴中的tau转变为结合荧光染料ThioS的无定形聚集体。由于这种染料可以染色淀粉样纤维，因此有人认为在液滴中形成的p-tau441聚集体具有丰富的β-Sheet结构，这与在淀粉样蛋白中发现的结构类似。然而，随后的一项研究(使用了非磷酸化的tau)发现，在没有任何辅助因子的情况下，在液滴中形成的聚集体与一种抗体发生反应，该抗体可以识别小的tau寡聚体，但不能识别成熟的纤维。后一种寡聚体与tau毒性相关，与纤维形成无关。类似于在溶液中的情况，tau在液滴中的原纤维形成需要阴离子辅助因子，这一观点与使用K18片段的研究一致。在这种情况下，在存在(而不是缺失)肝素的情况下，可以在液滴中粗略观察到蛋白质的原纤维形成。作者提出了一个模型，在该模型中，聚阴离子肝素在液滴中的高浓度K18上的募集增加了蛋白质/聚阴离子复合体的局部浓度，从而促进了淀粉样蛋白的形成。

用非磷酸化全长蛋白进一步探讨了tau LLPS和淀粉样纤维形成之间的联系，研究发现，重复区域内的致病突变极大地加速了液滴向低度活跃的集合体的转变。蛋白质在液滴中失去活力之后形成纤维状聚集体，每个蛋白质变体的原纤化速度比在大量溶液中要快得多。此外，与它们对液滴动力学的影响一致，且发现与疾病相关的突变显著增加了液滴内蛋白质原纤化率。致病突变对LLPS固有tau倾向的影响(野生型和突变蛋白基本上相同；见上文)与突变相关的液滴成熟和纤维形成的加速之间缺乏明显的相关性，这有力表明了不同类型的相互作用推动LLPS和随后的蛋白质凝聚/原纤维形成。

使用2N4R和2N3R tau亚型(具有本质上不同的聚集倾向)的混合物对tau原纤维形成的研究也揭示了在LLPS条件下tau原纤维形成的独特调节机制。在这一机制中，缓慢聚集的2N3R异构体的存在通过有效地降低液滴中2N4R异构体的浓度，导致通常较快聚集的2N4R异构体的原纤维形成速度降低。不同类型的tau病似乎与细丝中不同tau异构体的存在有关。虽然4R tau是与PSP、球状胶质瘤、CBD和衰老相关的tau星形胶质病相关的细丝中主要的(如果不是唯一的)亚型，但3R tau细丝仅存在于PiD中。然而，AD、CTE、与年龄相关的原发性肌萎缩侧索硬化症和一些家族性痴呆症与两种tau亚型形成的细丝有关。因此，在tau病中，这样的调节机制可能与变异表型的分子原理直接相关。此外，类似的调控机制可能适用于其他倾向发生LLPS和聚集的蛋白，由于选择性剪接，这些蛋白可能以几种具有不同聚集倾向的异构体存在。

图3：液滴内tau的原纤化

有充分的证据证明tau能在体外形成液态凝聚体，除此之外，越来越多的证据表明tau LLPS于细胞中存在。在这方面的研究最开始使用了融合了GFP的tau，发现这种蛋白在原代小鼠皮层神经元中的表达导致了富含tau的细胞质小滴的形成，这些小滴具有动态的、类似液体的特征。随后使用稳定的小鼠海马神经元细胞系HT22进行的研究证实了tau在细胞环境中发生LLPS的能力。有趣的是，这些细胞中的GFP-tau液滴呈中空，壳层中tau的浓度比液滴内部的浓度大得多。此外，研究发现，带负电荷的N-末端插入物对HT22细胞中的tau LLPS起着调节作用，与1N和0N亚型相比，2N-tau发生了更有效的缩合。后者的观察结果与在体外中的实验结果大体一致，显然支持相反带电区域之间的吸引静电相互作用在tau LLPS中起重要作用的观点。

通过使用tau与隐花色素-2蛋白Cry2融合的光遗传学方法，进一步探索了tau在细胞中缩合的机制和结果。这种蛋白质在蓝光照射下会经历光敏的自我结合，并已被用作研究其他蛋白质的LLPS的融合伙伴。在神经母细胞瘤SH SY5Y细胞中，不同结构域的tau与Cry2融合的研究表明，仅与富含Pro结构域对应的多肽在光激活时可以经历广泛的LLPS，并且在多个光照循环下，从凝聚期到稀释期的转变变得越来越不可逆。相比之下，在用伪重复多肽进行的类似实验中没有观察到LLPS，这表明了富含脯氨酸的结构域在这一过程中的重要性。此外，有报道称，在富含Pro的多肽中引入拟磷突变，或在该片段上添加N-末端结构域，可以消除光诱导的LLPS。后者的发现与前述研究得出的结论明显相反，在生理上更相关的自然存在的tau亚型包含不同数量的N-末端插入。

另一项使用同样的光遗传学方法的研究进一步复杂化了这一情况，该研究中发现，全长tau(1N4R亚型)在SH-SY5Y细胞中形成光诱导的细胞质颗粒是罕见的。相反，在培养的大脑皮层神经元中观察到了这种颗粒的粗略形成。虽然这些颗粒在短时间光照下基本可逆，但在较长时间或重复光照下诱导后变得稳定，这些包涵体中的tau形成稳定的寡聚体，能够使伪重复多肽在tau K18传感细胞系中聚集。作者还发现tau寡聚导致与N6-甲基腺苷RNA(M6A)相关的RNA结合蛋白hnRNPA2B1的细胞质易位，表明与hnRNPA2B1和m6A的寡聚tau复合体调节RNA翻译应激反应，促进应激颗粒的形成。这一发现与tau病的发病过程有潜在的相关性，因为m6A-hnRNPA2B1与寡聚tau的复合体在AD大脑中的水平升高。

除了hnRNPA2B1，过度磷酸化的tau已被证明与其他几种RNA结合蛋白共存于神经元包涵体中，这些RNA结合蛋白是应激颗粒的标志。其中最重要的似乎是T细胞胞内抗原1(TIA1)。一系列研究探索了tau-TIA1相互作用的不同方面以及这些相互作用在神经退行性疾病中的作用，揭示了tau的表达水平和致病突变调节了tau和TIA1阳性应激颗粒的形成，并表明颗粒内的TIA1-tau相互作用促进了tau的错误折叠和毒性。这一概念与减少TIA1表达提供神经保护和减少tau病理的发现是一致的。重要的是，TIA1的这种促进tau病理的作用似乎与其促进有毒tau寡聚体的形成的能力有关，正如在表达tau的P301S小鼠的大脑中观察到的那样，并在使用纯化蛋白的体外研究中进一步证实。Tau与TIA1和其他应激颗粒标记蛋白共定位的观察结果本身并不能证明这些蛋白确实定位于动态应激颗粒中。然而，tau可以被招募到这样的颗粒中的观点直接得到了HEK293T细胞中它被亚砷酸钠诱导的的应激颗粒的证据的支持。

在细胞中研究tau LLPS的一个有趣的转折是，最近发现来自老年P301L tau小鼠的细胞外tau聚集体的摄取导致tau在表达P301L 0N4R tau或P301L/V377M K18 tau片段的细胞的核膜上凝聚。这些凝聚体是高度动态的，表明它们是通过LLPS机制形成的。重要的是，核膜上的tau凝聚被发现触发了核孔复合体中核孔蛋白的隔离，破坏了分子在核膜上的运输，最终导致了细胞凋亡，这表明了LLPS介导的tau毒性的另一种机制。，tau聚集体集中在核斑点中，改变了这些通常参与前mRNA剪接的无膜细胞器的组织和动力学，这一发现支持了核蛋白凝聚体也参与tau的毒性的观点。这些效应可能通过导致核RNA处理的改变来促进AD和相关疾病的神经退化机制。然而，目前还不清楚Tau LLPS本身是否参与了这一过程。

Tau是一种与几种神经退行性疾病有关的蛋白质，它有一种内在的倾向，无论是在自身还是在RNA和/或蛋白质伴侣存在的情况下，都有发生LLPS的内在倾向。这导致了液滴的形成，在液滴中蛋白质浓度大大增加。Tau同型和异型LLPS的主要驱动力似乎是可由PTMs调节的静电相互作用，尽管这种调控机制的细节仍然知之甚少。最初高动态液滴中tau凝聚的后果之一是蛋白质加速聚集成淀粉样纤维，具有不同内在聚集倾向的不同tau亚型的存在可以独特的方式调节这一过程。尽管对tau LLPS在神经元中的研究仍处于早期阶段，但这些研究已经清楚地证明了tau在不同的细胞间隔中进行缩合的能力，确定了几个与tau在细胞颗粒中共存的蛋白质伴侣，并提供了关于tau缩合可能促进神经退化的潜在机制的有趣提示。然而，许多关于tau LLPS在疾病发病机制中的作用的重要问题仍然没有得到回答。其中一个尚未探索的问题与最近的突破性发现有关，即不同表型的tau病，如AD、PID或CBD，与大脑中结构上不同的tau细丝菌株的积累有关。LLPS诱导的tau和/或隔室特异性辅助因子的区间化能促进tau聚合成结构不同的细丝吗？这种可能性耐人寻味，亟待探索。此外，如果无膜细胞器确实是tau聚集的部位(或其中一个部位)，那么问题就出现了，tau细丝和/或寡聚体如何从这些隔室中释放出来，作为促进tau病理化在脑内呈prion样传播的“种子”。

活细胞中蛋白质凝聚体的结构和功能特性的研究面临着巨大的技术挑战。虽然这些挑战使创新方法和研究战略得以快速发展，但这些新方法中，大多数尚未被用于tau LLPS的细胞方面的研究。例如，应用新出现的邻近标记方法，像依赖邻近的生物素鉴定(BioID)，可能会提供关于含tau的无膜细胞器中相互作用的伙伴的动态网络的丰富信息。此外，到目前为止，使用强大的光遗传学方法来研究含有tau的凝聚体仅限于基于Cry2的光滴状体系，其局限性是对Cry2-Cry2相互作用的性质知之甚少。将这些研究扩展到新兴的下一代光遗传系统，如小核，应该可以克服这些限制，从而从机制上更好地理解tau凝聚及其细胞后果。最后，通过原位冷冻电子断层扫描(一种在研究细胞内亚结构方面极具潜力的技术)，可能会提供对含tau凝聚体的结构和生物物理性质的更多见解。

1.  单独存在或以RNA的形式存在的tau有高度倾向进行LLPS并形成液态小滴。

2. 在生理相关的缓冲条件下，全长tau的LLPS很大程度上是由相反带电的蛋白质区域之间或tau与RNA之间的分子间静电相互作用驱动的。

3. 磷酸化和其他翻译后修饰似乎在tau LLPS中起着调节作用。

4. LLPS对tau聚集成淀粉样纤维有重要影响。凝聚体中存在的多种tau异构体，也导致了原纤维形成的独特调节机制。

5. 在神经元中，tau会经历LLPS，这可能有助于该蛋白的正常生物学功能或导致神经退行性疾病中的tau病理改变。

原文：

编 译 / 陆 星 宇

校 审 / 梁 春 梅

小崔和他的小伙伴们