恭喜！北京大学李毓龙课题组GRAB探针的工作入选 Best of Neuron 2021-2022

2022年12月15日，Cell Press旗下《Neuron》期刊推出了2021-2022年度最佳论文（Best of Neuron 2021-2022），北京大学生命科学学院、IDG麦戈文脑科学研究所、北大-清华联合中心李毓龙教授课题组发表的题为“A sensitive GRAB sensor for detecting extracellular ATP in vitro and in vivo”的研究论文入选。

这篇论文运用GRAB探针（GPCR Activation-Based sensor）构建策略，基于人源ATP受体P2Y1和循环重排的绿色荧光蛋白cpEGFP开发了新型基因编码的三磷酸腺苷（ATP）荧光探针GRAB_ATP1.0，该探针能够在培养细胞、活体斑马鱼和小鼠中实现对细胞外ATP高灵敏度、高选择性、高时空分辨率的检测，新工具的开发将助力科学家更加深入地研究ATP信号传递在生理和病理条件下的功能和调控机理。

下面是详细介绍：

Neuron：又有新探针——李毓龙实验室开发GRAB荧光新探针！

在这一工作中，李毓龙实验室运用其先前设计的GRAB探针策略（GPCR Activation-Based sensor)，基于人源ATP受体P2Y1和循环重排的绿色荧光蛋白cpEGFP开发了ATP探针GRABATP1.0（简称为ATP1.0）。在体外培养的HEK293T细胞、原代神经元及星形胶质细胞中，ATP1.0探针均表现出优异的细胞膜定位。神经元表达的ATP1.0对外源加入的ATP及ADP有~780%的信号响应、~80 nM的亲和力（EC50），及高度的分子特异性（图1）。此外，ATP1.0能够在亚秒级别响应胞外ATP浓度的变化。

图1：ATP1.0在HEK293T细胞、星形胶质细胞及神经元上的表现

ATP1.0探针能否用来检测内源释放的ATP呢？作者从原代培养的海马细胞入手，发现ATP1.0能够检测到机械刺激及低渗透压刺激引发的ATP释放，药理学实验及突变型探针实验进一步验证了ATP1.0检测信号的特异性（图2）。有意思的是，在不给予额外刺激时，ATP1.0也能灵敏地记录到直径约为30微米的自发性ATP释放事件，表明ATP的释放具有化学分子特异和空间特异性。

图2：ATP1.0在原代培养的海马细胞中检测内源ATP的释放

ATP1.0探针能否在活体动物加以运用呢？过去的研究发现，当细胞受到损伤时，胞内毫摩尔级别的ATP被释放胞外，作为“危险信号”被周围的胶质细胞感受，从而激活小胶质细胞释放趋化因子等，产生免疫反应。胶质细胞上表达的嘌呤类受体在小胶质细胞激活、迁移及分泌信号因子过程中发挥重要作用。那么，在这一过程中，信号分子ATP的传播和小胶质细胞的迁移是如何动态并变化的？作者将ATP1.0探针表达在斑马鱼中，通过激光照射引发局部损伤时发现ATP的释放呈现“波状”传播；通过将绿色ATP1.0探针表达在红色荧光蛋白标记小胶质细胞的转基因斑马鱼中，能够直观地检测到随着ATP信号的传播小胶质细胞的迁移过程（图3上）。

图3：ATP1.0报告斑马鱼受到局部损伤时及小鼠发生免疫反应时大脑中的胞外ATP信号

当大脑处于疾病状态时，ATP的释放又会呈现什么样的变化？如上所述，嘌呤能信号在免疫中扮演着重要角色。为了检测免疫反应过程中大脑中ATP信号的变化，作者通过腹腔注射脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）的方式引发小鼠的系统性免疫反应，同时通过AAV病毒介导的方法将ATP1.0表达在小鼠的大脑皮层，并借助双光子成像记录ATP的信号。有意思的是，LPS注射后，小鼠大脑皮层呈现出强烈、但空间特异的ATP信号上升现象（见视频）。

除了开发高灵敏的ATP1.0探针外，作者还开发了反应动力学更快及亲和力更低的ATP探针ATP1.0-L。在神经元中表达的ATP1.0-L对胞外的ATP的亲和力（EC50）约为32 μM。当在原代培养的海马细胞及活体的斑马鱼中表达，ATP1.0-L均能检测到更加局部的ATP信号。

综上所述，在这项工作中作者开发了新型遗传编码的ATP荧光探针，实现了对胞外ATP的高时空分辨率的记录。在此之前，李毓龙课题组在2020年还开发了另外一种嘌呤类递质腺苷的GRAB荧光探针，并助力中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心徐敏团队在睡眠调控中的研究。相信一系列新型成像工具的开发，将助力科学家更加深入地研究嘌呤能信号传递在生理和病理条件下的功能和调控机理。

北京大学生命科学学院博士后武照伐为本文第一作者，李毓龙教授和武照伐博士为共同通讯作者，本科毕业生何凯凯、博士研究生潘孙磊、李柏翰、邓飞和王欢等对文章做出了重要贡献。

该工作得到了北京脑科学与类脑研究中心井淼团队（陈阅、席凤雪）及中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心杜久林团队（李红羽、刘亭亭）等的通力合作，并得到了北京大学膜生物学国家重点实验室、北大-清华生命科学联合中心、国家自然科学基金、北京市科委、峰基金及勃林格殷格翰博士后奖学金等机构和经费的大力支持。

Neuron最佳论文

Best of Neuron

自2012年以来，Neuron期刊从上一年第四季度和本年前三个季度发表的文章中，遴选访问量最高的若干研究和综述作为年度最佳论文（Best of Neuron）。Best of Neuron 2021-2022收录了两篇综述和十篇研究文章，以纪念2022年的神经科学研究，这些文章在过去的一年里极大地吸引了Neuron读者，涵盖了广泛的神经科学领域，包括基础环路生理学、分子神经生物学、神经系统疾病、认知神经科学和神经技术等。

课题组介绍

李毓龙

北京大学生命科学学院教授

北京大学IDG麦戈文脑科学研究所PI

北大-清华生命科学联合中心PI

研究领域

实验室研究集中在神经元通讯的基本结构突触上，从两个层面上开展研究：

一、开发前沿的工具，即开发新型成像探针，用于在时间和空间尺度上解析神经系统的复杂功能；

二、借助先进的工具探究突触传递的调节机制，特别是在生理及病理条件下对神经递质释放的调节。