David Liu最新Cell综述：体内基因治疗的编辑策略及药物递送载体的选择

目前已有多种类型的基因编辑工具应用于体内基因编辑。下文将会简单介绍这些基因编辑技术并讨论相关的体内递送方法。

 三大治疗性基因编辑技术示意图

巨核酸酶、锌指核酸酶（ZFNs）和转录激活因子样效应物核酸酶（TALENs）是最早用于哺乳动物细胞基因编辑的酶。然而，这些编辑工具需要通过复杂的蛋白质和DNA 的相互作用来结合切割前的特定 DNA 序列，因此必须为每个新的基因组靶点设计和构建新的编辑蛋白。实际操作中，这些设计会耗费大量的时间和资源。

CRISPR-Cas 核酸酶的发现使基因编辑发生了革命性的变化。这些酶可以通过靶DNA 与 Cas 蛋白内的 sgRNA 之间的 RNA:DNA 碱基配对来识别靶标。这一显著的特点可以使研究人员利用 CRISPR-Cas 核酸酶来靶向和切割不同的基因组位点：仅需改变 sgRNA 的20个碱基对的序列，而不需要重新设计新的 Cas 蛋白。当前，CRISPR-Cas 核酸酶已经成为迄今为止使用最广泛的能在哺乳动物细胞中产生靶向 DSB 的酶。

在哺乳动物细胞中，DSB 通常通过非同源性末端接合（NHEJ）或微同源介导末端连接（MMEJ）来修复。这两种方法都会在靶位点产生不可控的小序列插入和缺失（indels）。在某些情况下，DSB 也可以通过 HDR（同源定向修复）来修复。这一过程可以通过外源 DNA 供体进行模板化，原则上可以在基因组 DNA 中插入任何想要的序列。然而，HDR 在包括不分裂的细胞在内的大多数细胞类型中是低效的，并且成功的 HDR 编辑通常伴随着大量的错误插入和缺失。

由于上述的这些原因，核酸酶介导的基因编辑并不是一种最佳的通用策略，因为最佳的通用策略需要精确地纠正突变基因，同时要产生最少的不必要的编辑副产物。核酸酶产生的 DSB 最佳的应用场景其实是通过引入移码突变来干扰基因的编码序列或通过干扰非编码序列中的调控基序来调节基因的表达。事实上也是如此，绝大多数用核酸酶进行的体内基因编辑研究都利用对目标基因组位点的破坏来达到治疗效果。关键点在于，DSB 介导的插入与缺失结果是不可控制的，通常会产生由不同可检测序列组成的混合物，每一个插入和缺失序列都会对疾病的生物学发生产生不同的影响。

虽然可编程核酸酶已被用于治疗，但已有报道表明其介导的基因编辑可能会产生一些不良后果。除了在靶位点产生小插入和缺失外，在基因组 DNA 中诱导 DSB 还可能会导致大基因片段的丢失、染色体易位、染色体碎裂或其他染色体异常。这些编辑结果虽然罕见，但存在安全风险，可能会对核酸酶的某些临床应用产生负面影响。核酸酶编辑的这些缺点，以及 HDR 在大多数治疗相关性细胞类型中的低效性，促使人们开发更精确的基因编辑替代策略。

碱基编辑器通过基因组 DNA 中的单核苷酸转换实现精确的基因校正，而无需产生DSB，从而克服了核酸酶的许多限制。碱基编辑器由 DNA 修饰酶与可编程的 DNA 结合结构域融合产生，迄今为止已报道了多种碱基编辑器。

第一个被报道的碱基编辑器是胞嘧啶碱基编辑器（CBE），它执行靶向 CG 到 TA的转换，由胞嘧啶脱氨酶与催化受损的 Cas 酶和尿嘧啶糖基酶抑制剂（UGI）组成。在典型的 CBE 中，催化受损的 Cas 酶会首先结合到一个特定的基因组位点，而不产生 DSB 。引导 RNA 和目标 DNA 链之间的碱基配对会暴露出一个单链DNA 泡（DNA双链中的局部单链区），这个 DNA 泡可以通过融合的胞苷脱氨酶结构域进行脱氨。因为融合的胞苷脱氨酶对单链 DNA 底物具有特异性，因此脱氨仅被限制在暴露的 DNA 链内的一个小窗口上。

胞嘧啶（C）脱氨产生尿嘧啶（U），融合的 UGI 会在一定程度上保护尿嘧啶，使其不经历碱基切除。这会导致碱基U和G在目标 DNA 位点无法正确匹配。催化受损的 Cas 酶只选择性地切割未编辑的含有G的单链，而不产生 DSB ，这会使细胞错配修复以编辑后的链为模板来取代未编辑的链。由此产生的 U-A 碱基对最终通过细胞修复机制转化为 T-A 碱基对，从而最终实现了 CG 到 TA 的转换。

如果含尿嘧啶的中间体没有得到保护，而是促进了尿嘧啶的切除，结果往往会导致CG 到 GC 的转化，而不是 CG 到 TA 。已有学者利用这一现象设计出了 CG 到 GC 的碱基编辑器（CGBE）。

腺嘌呤碱基编辑器（ABE）可通过类似的机制实现 AT 到 GC 的转换。由于没有已知的天然酶能催化脱氧腺苷的脱氨，而脱氧腺苷是 DNA 中编辑腺嘌呤所必须的，因此迄今所描述的所有 ABE 都使用实验室生成的脱氧腺苷脱氨酶。ABE 是一种特别有用的碱基编辑器，因为它们逆转了最常见的致病点突变类型（CG到TA)，这种突变约占已知致病性单核苷酸突变的一半左右。

线粒体有自己的基因组，线粒体 DNA 的突变也会导致许多遗传疾病。由于缺乏将引导 RNA 递送到线粒体内的合适方法，学者们无法有效使用基于 CRISPR-Cas 的基因编辑系统，这对线粒体 DNA 编辑构成了很大的挑战。因此，很长一段时间内，学者们只能在线粒体中进行针对性的基因破坏，而无法实现精确的基因编辑。

DdCBE 是一类特殊的胞嘧啶碱基编辑器，它使用了一种独特的作用于双链 DNA 底物的胞苷脱氨酶结构域，它的成功开发实现了对生命系统中线粒体 DNA 的首次精确编辑。最近，Kim 等人报告了一种线粒体 ABE（TALED），这种 ABE 将来自 DdCBE 的催化受损的胞苷脱氨酶结构域与实验室获得的脱氧腺苷脱氨酶结构域相结合。DdCBE 和 TALED 使用 TALE 蛋白而不是 Cas 结构域来将脱氨作用导向特定的 DNA 位点，这使得它们可以对线粒体 DNA 进行无 CRISPR 碱基编辑。这两种编辑器也同样适用于细胞核 DNA 编辑。

自最初的 CBE 和 ABE 成功问世以来，许多实验室报道了数百种不同性质的碱基编辑器。碱基编辑器已被成功运用于各种体外和体内治疗性基因编辑，它们或纠正致病点突变，或插入了单核苷酸变异以预防或治疗疾病。

虽然碱基编辑器原则上可以纠正大多数致病性单核苷酸突变，但是它们不能执行所有可能的单碱基转换，也不能介导靶向插入或删除。为了突破这些限制，刘如谦课题组开发了先导编辑器（PE），PE 可以在不生成 DSB 的情况下，实现任何单核苷酸转换、小序列插入或删除、以及其中的组合形式。

PE 由逆转录酶和 Cas9 切口酶结构域融合生成，使用定制化的先导编辑引导 RNA（pegRNA）将 Cas9 切口酶引导到一个特定的目标位点以实现既定的基因编辑。PE 首先切割非靶向 DNA 链，然后在由此产生的3‘端上，利用 pegRNA 扩展区域作为模板启动逆转录。在既定的基因编辑加入到新合成的 DNA 链后，可以使用一个额外的缺口来引导细胞 DNA 修复，以已编辑的新链作为模板来取代未编辑的链。

已有学者报道了几个利用 PE 来进行体内基因编辑的例子。最近对 PE蛋白和 pegRNA 的改进使得其在各种类型的细胞中都能实现高效的先导编辑，这对未来的体内先导编辑研究工作应该是大有裨益的。

基因编辑药物可通过DNA、mRNA、蛋白质或者核糖核蛋白（RNP）的形式存在。将这类大分子药物成功地递送到细胞内需要突破多个生理屏障：（1）在药物进入细胞之前，需避免药物与载体解离或药物降解；（2）靶向特定细胞；（3）穿过细胞膜进入细胞内部：（4）在特定的细胞器中释放药物。

基因编辑药物体内高效递送载体的要求（来源：Cell）

绝大多数基因编辑药物载体将药物封装在蛋白或脂质壳中，可稳定药物在循环系统或者给药位点的结构，直至药物达到靶细胞。此外，运输载体需要避免被免疫系统识别，防止免疫系统激活后的靶向降解。例如，载体的某些组分可能激活补体系统，导致由吞噬免疫细胞的清除；抗体识别递送载体也会导致非预期的吞噬清除。

将药物递送到靶细胞内部首先需要递送载体结合这些细胞，这一过程高度依赖给药途径。静脉注射递药载体可以实现高效的肝脏靶向，但由于存在某些生理屏障（如血脑屏障），载体进入中枢神经系统（CNS）等组织非常困难。通过鞘内注射或者眼内注射（如视网膜下注射）可以绕过一些生理屏障，实现CNS或眼细胞靶向。但是，载体接近特定类型的细胞并不能保证与这类细胞结合，此时可以在载体表面嵌合特异性的靶向基团，通过识别靶细胞表面的受体促进载体与靶细胞的结合与内吞。

载体与靶细胞结合后，递药平台还需要穿过细胞膜进入细胞。许多情况下，载体与细胞表面受体结合后可激活细胞的内吞作用，载体通过内涵体进入细胞。但是，如果载体长时间停留在内涵体中，载体与药物一道将被降解。因此，载体必须实现内涵体逃逸，在内涵体外部将药物释放到细胞质中。很多载体都是利用内涵体的酸性环境触发载体结构变化从而实现上述过程的。总的来说，一种高效的递送载体必须在细胞外具有足够的稳定性保护药物结构，而在内涵体中可迅速解聚、释放药物。

几十年来，研究人员开发了几种可以突破各类生理屏障的递送载体，目前研究最为充分的包括病毒载体、脂质纳米颗粒和病毒样颗粒。

病毒在自然进化过程中不断克服体内递送的障碍，从而天然具备可以将核酸递送进入多种细胞的能力，因此病毒载体成为基因治疗领域较为热门的载体，已经有多种病毒载体被开发用于体内基因治疗、相关临床试验超过1,000项，其中大多数采用腺相关病毒（AAV）、少数采用慢病毒或腺病毒。值得注意的是，已经有一项治疗遗传性失明的临床试验，采用AAV将基因编辑药物递送至眼睛。

各种病毒载体的比较分析表

3.1 AAV载体

AAV是一种约25nm的无包膜病毒，由60个拷贝的病毒蛋白VP1、VP2、VP3组装成正二十面体衣壳。AAV能包装约5kb的单链DNA，已被应用于递送很多获批和正在临床开发的基因疗法，是目前最流行的用于递送DNA的病毒载体。

AAV载体有诸多优势，安全性较好，生物相容性高，能有效递送至多种组织器官，包括眼、肝、脑、心肌和骨骼肌等，而不同的天然存在的AAV衣壳血清型能用于转染不同的组织，给研究者提供不同的靶向性。实验室定向进化和理性设计改造，能够进一步扩展AAV衣壳的组织靶向性，但目前还很少有通过这种改造的AAV进入临床。

使用AAV载体时，核酸片段大小是一个重要的考量因素，因为其包装容量仅为5kb，而且两段必须有两个反向末端重复序列（ITR），使得真正可用的转基因区间只剩下4.7kb左右。这种容量限制了AAV用于搭载基因编辑的潜力，因为多数使用SpCas9的base editor和prime editor都很难用一个AAV装下。除了DNA编码序列和gRNA，AAV载体还需要包装启动子和顺式调控元件等，这些额外成分都进一步限制了搭载能力。

将基因编辑药物分成两部分，每部分以一个AAV单独封、同时给药，在细胞内递送两段基因编辑药物的AAV共转染，在DNA、前体mRNA或蛋白水平重组为全长基因编辑药物。

其中，mRNA和蛋白质反式剪接策略已应用于重组全长基因编辑药物。例如，多个实验室已经成功开发了由蛋白质内含肽介导的蛋白反式剪接重组策略。在这些应用中，断裂成两段的基因编辑药物每段都要与蛋白质内含肽融合后再分别封装到独立的AAV衣壳中。共转染的细胞中，两段基因编辑蛋白分别表达，在蛋白质内含肽二聚化的帮助下实现反向剪接，重构全长蛋白。

蛋白质内含肽介导的蛋白质反向剪接方法的碱基编辑效率是mRNA反式剪接策略的4.5倍。这种差异可能来源于mRNA剪接过程共需要2步，包括AAV基因组拼接，随后是ITR序列的转录与剪接，这会破坏前体mRNA的稳定性。因此，蛋白质内含肽介导的蛋白质重构策略更具实用性。

单一AAV递送载体具有双AAV载体无可比拟的优势。一方面，单个AAV载体可以降低实现有效基因编辑水平的AAV给药剂量。另一方面，同时转染多个AAV较为困难，单个AAV策略可以提高基因编辑效率。此外，由于AAV可导致剂量限制性毒性，降低AAV剂量可以提高给药安全性。

鉴定Cas9小体积同源物，或者生成小体积工程化Cas9突变体使得以单个AAV递送CRISPR基因编辑药物成为可能。来自金黄色葡萄球菌的Cas9核酸酶（SaCas9）在单个AAV方法中常用，其尺寸仅为3.2 kb，可与1~2个向导RNA表达盒共封装于单个AAV中。最近又发现了一些其他的小体积Cas9突变体，如Nme2Cas9（3.24 kb）、CjCas9（2.95 kb）、SauriCas9（3.18 kb），这些新发现丰富了单个AAV载体可封装的Cas9酶工具箱，拓宽了单个AAV载体的靶向范围。

由于AAV基因组主要游离于细胞核中，因此表达可长达数年， AAV递送的问题之一在于基因编辑药物在转染细胞中长时间表达。长时间的表达对基因增产疗法（gene augmentation therapy）可取，但由于存在各种脱靶问题，基因编辑药物的长时间的表达是不可接受的。此外，长期非人源Cas9表达将触发免疫反应，表达此类Cas9的细胞将被免疫系统攻击。为解决这一问题，开发了许多瞬时表达AAV递送的基因编辑药物的策略。

研究人员开发了自灭活CRISPR/Cas9 AAV系统。这种策略将片段插入/缺失多态（indel）引入AAV基因组中，基因编辑药物的表达将触发自灭活。尽管小鼠实验中，这种技术在未显著降低在靶编辑的前提下发挥了一定作用，但基因编辑药物的表达没有完全被阻断，此外还发现了AAV片段整合到目标基因组位点中，具有安全性风险。

X^on是一种采用小分子控制RNA选择性剪接来精密调控AAV转基因表达的方式。在小分子诱导剂存在的情况下，药物调节的剪接促使含有起始密码子的外显子形成完整的mRNA，表达全长蛋白；而没有小分子诱导剂，该外显子被排除在mRNA之外，基因编辑药物无法正常表达。

以上两种策略都是时间依赖性的，研发人员还开发了空间依赖的基因编辑药物表达控制策略。研究人员使用了组织特异性的AAV衣壳、启动子或miRNA，基因编辑药物的表达被局限在特定组织中，最大限度减小了在非靶组织中的脱靶编辑。尽管自然产生或实验室来源的AAV衣壳拓展了AAV的递送范围，但是并不能保证AAV递送的特异性。利用组织特异性的启动子驱动基因编辑药物表达是一种很有吸引力的策略，但受封装尺寸影响，启动子的选择余地不大。在Cas9表达盒的3’UTR区中加入将内源性miRNA结合位点是调控基因编辑药物表达的有效策略。Cas9蛋白表达仅限miRNA低表达的组织，在高表达miRNA的组织中该蛋白将被沉默。

3.2 慢病毒载体

慢病毒（LV）是一种来源于HIV-1的包膜病毒，通过3' LTR缺失和拆分病毒生产所需原件来使其无法自我复制。LV可以递送RNA，通过逆转录后半随机地整合到转染细胞基因组中；也有被改造的IDLV，其整合酶结构域失活，从而病毒cDNA在逆转录后仍保持游离状态。LV主要用于体外基因递送，特别会对造血干细胞和T细胞，已有多种通过LV转染的CAR-T疗法获批。

LV有多种对基因编辑较为有利的优势：首先是它可以搭载高达10kb的片段，足以将已知所有的基因编辑元件包装进单个载体，这也非常适合递送基于CRISPR且需要多个sgRNA的多重编辑系统；其次，LV可以有效转染分裂期和非分裂期的细胞；再次，IDLV基因组也可以作为HDR模板；最后，可以通过改变病毒粒子的包膜糖蛋白来调控LV的亲嗜性。

LV用于体内基因编辑的案例还较少，其显著缺点就是会整合进基因组，尽管改造IDLV目的是非整合性的，但仍存在一定的整合可能性，并且也存在基因编辑器长期表达而导致脱靶风险升高的问题。事实上，体内通过LV转染的基因疗法在临床应用中，的确带来遗传毒性、免疫原性以及高生产成本等诸多问题，限制了LV载体在体内基因编辑的应用。

3.3 腺病毒载体

腺病毒（Ad）是一种二十面体的无包膜病毒，约90-100nm，拥有较大的基因组（约36kb），可以递送DNA片段，在转染细胞核中保持游离状态。Ad是目前基因治疗临床试验中最常用的病毒载体（占比>20%），主要因为它具有超大的包装容量、明确的生物学特性、基因稳定性、高转染效率以及适合高滴度大规模生产，此外有57种已知的Ad血清型可以转染人类和约100种可以转染灵长类动物，让研究者可以通过使用不同衣壳来调整亲嗜性。

已有Ad应用于人体内编辑的研究，例如使用Ad将ABE递送至HSC，破坏胎儿血红蛋白启动子中的阻遏蛋白结合位点，用于治疗镰状细胞病和β地贫。

虽然Ad递送基因编辑器能够在体内有效编辑，但也导致产生对Cas9的中和抗体，可能是由于载体的免疫原性。因此，将Ad用于体内基因编辑的缺点包括免疫原性且易引起T细胞介导的细胞毒性等，通过尽可能减少病毒抗原表达可降低免疫原性。腺病毒在新冠肺炎疫苗中的应用带来了更多关注，但在体内基因编辑递送方面的更广泛应用仍有距离。

3.4 病毒载体递送体内基因编辑的未来

总体上，病毒载体在递送体内基因编辑方面展现出巨大的前景，提供了较高的基因编辑效率，未来仍需要对病毒载体持续改进以克服多项挑战，包括免疫原性、长期表达问题、脱靶编辑、基因组整合风险、生产成本和剂量限制性毒性等。通过工程化改造来提高活性和组织特异性，可以有效降低剂量和制造成本。靶向编辑后沉默基因的持续表达，也可以显著改善安全性。

如下所述，通过将病毒载体的高效率和非病毒载体的瞬时表达特性相结合，有可能产生混合的最佳策略。

几十年来，脂质纳米粒（LNP）一直作为核酸药物的递送载体，包括siRNA和mRNA等。LNP包裹搭载物后，首先通过内吞作用进入细胞，通过酸化破坏内涵体膜进入细胞质。LNP完全由化学合成，通常由四种成分组成：阳离子或可电离脂质体、辅助脂质体、聚乙二醇（PEG）脂质体和胆固醇，改变这些成分可以产生具有不同性质的LNP，包括不同的PK特性和靶向不同的细胞类型。

FDA已批准LNP递送的静脉注射治疗性siRNA和肌肉注射mRNA疫苗，且LNP也正在用于向肝脏递送Cas9 mRNA的临床试验，有望成为许多体内基因编辑应用的选择。

4.1 LNP用于肝脏递送

大多数静脉注射的纳米颗粒会在肝脏富集，具体到LNP会在血中被ApoE脂蛋白包裹，通过ApoE:LDL受体介导的相互作用被肝细胞所摄取，因而LNP最常见的应用就是将治疗药物递送至肝脏。

虽然最初LNP是针对递送siRNA进行设计优化，但最重要的进展是成功地封装和递送了mRNA。目前已经有研究，将用于mRNA递送的LNP配方进行优化，来尝试将表达SpCas9核酸酶的mRNA递送至肝脏，这种mRNA以假尿苷和5'-甲基胞苷修饰来提高稳定性和降低免疫原性。最初LNP只是递送SpCas9 mRNA，而sgRNA和HDR供体DNA模板是由AAV8载体递送；后来，将sgRNA以2’-OMe、2’-F和硫代磷酸酯修饰后再封装在LNP中，可实现更强的基因编辑效率，在小鼠模型中静脉注射同时封装SpCas9 mRNA和经化学修饰的靶向PCSK9的sgRNA，基因编辑效率高达80%以上，血清PCSK9降低到检测不到的水平以下。

除了递送Cas9核酸酶的mRNA，LNP还被用于递送Base Editor的mRNA，目前有研究将ABE mRNA、SaCas9-BE3 mRNA等递送至小鼠和食蟹猴等，实现10%以上的编辑效率，表明使用LNP进行肝靶向递送碱基编辑器的策略有一定前景。

4.2 LNP用于非肝脏递送

由于大多数静脉注射的LNP会在肝脏中富集，靶向非肝脏的LNP递送基因编辑具有一定的挑战性。一种可能的方式是通过局部注射，例如有过研究，局部注射脂质包裹的RNP后，在小鼠内耳和视网膜中实现核酸酶编辑和碱基编辑；但毕竟局部给药的应用范围还是太窄，开发能全身给药的LNP载体来实现非肝脏递送，才能大大拓展应用范围。

一种方法是在体内同时大量筛选LNP，使用独特的DNA条码标记不同的LNP配方，将混合条码文库的LNP注射到小鼠体内，并对从不同组织中提取的条码进行测序，来对应递送到该组织的LNP配方，目前已经能在小鼠中将Cas9 mRNA和sgRNA递送至脾内皮细胞，且做到与递送至肝细胞相当的效率；另一种方法是选择性器官靶向（SORT）的LNP，通过额外添加带电脂质组分来调节纳米粒的内部电荷，而基本上不破坏LNP的标准组分，目前SORT LNP已经能将Cas9 mRNA和sgRNA递送至肺组织，基因编辑效率约15%，但这种调节LNP组分来赋予靶向能力的具体机制尚不明确。

还有一种实现非肝脏靶向的策略，是将靶向基团（如抗体片段）偶联到LNP表面，例如将CD5抗体-LNP偶联物静脉给药后可以靶向T细胞，瞬时转染产生治疗小鼠心脏损伤的CAR-T细胞，目前这种主动靶向策略尚未在人体中验证，但提供了LNP非肝脏靶向的潜力。

4.3 LNP递送的优势和未来展望

与病毒载体相比，LNP在递送基因编辑方面有几项优势：首先LNP递送可以实现瞬时表达，而不像病毒递送可能长时间表达，从而最大限度降低脱靶概率，也降低转染细胞被免疫系统供给从而影响细胞长期发挥作用的可能性；其次，LNP由于是合成的，其免疫原性远低于病毒，部分情况下可以支持重复给药；再次，目前使用的LNP组分在体内可分解且无毒，足以支持有效递送基因编辑的剂量，迄今为止都展现出很好的安全性特征；最后也是最重要的是，LNP的大规模生产工艺已经成熟，为使用LNP递送体内基因编辑药物的临床试验提供了基础。

开发非肝脏靶向的LNP载体仍是基因编辑领域的关键目标，了解不同的LNP配方和实现不同组织靶向性的机理，可能设计出更好靶向性的新LNP。目前HSC的基因编辑受到高度关注，LNP可以通过静脉或骨内注射，将基因编辑药物递送至骨髓造血干细胞，在无需采集、体外编辑、移植这一系列操作的情况下，彻底颠覆遗传性血液疾病的现有治疗模式。总的来说，考虑到近年来LNP在递送多种其他RNA药物取得的成功，LNP有望广泛地应用于肝脏和其他器官的体内基因编辑递送。

病毒样颗粒（VLP）由无感染性的病毒蛋白组成，除病毒遗传物质以外，还可以包裹递送mRNA、蛋白质或RNP等。VLP来源于现有的病毒支架，可利用病毒的天然特性实现有效的细胞内递送，具有封装药物、内涵体逃逸和被重编程来靶向不同细胞等功能。然而，与病毒载体不同，VLP以mRNA和蛋白质而非DNA的形式，来进行基因编辑药物的瞬时递送，这显著降低了脱靶编辑和病毒基因组整合的风险。因此，VLP成为递送基因编辑药物很有吸引力的载体。

几乎所有报道的用于递送mRNA或蛋白药物的VLP都基于逆转录病毒，这种病毒具备作为VLP的几种理想特性：首先未成熟的逆转录病毒颗粒呈球形，通常缺乏刚性对称结构，与大多数无包膜的二十面体病毒载体相比，可以增加封装药物的灵活性；其次逆转录病毒直径较大（100-200 nm），提供了更大的装载空间；最后逆转录病毒可实现模块化设计，用包膜糖蛋白来控制细胞靶向性，用衣壳蛋白来控制药物封装，而各类衣壳结构可以轻松地与包膜糖蛋白组装结合。尽管逆转录病毒VLP作为mRNA和蛋白质的递送载体已经被探索了几十年，但近期首次实现了VLP介导基因编辑的有效递送。

5.1 VLP递送mRNA

VLP包装的mRNA通过独特的分子机制被特定的病毒衣壳蛋白识别，随后整合到病毒粒子中。逆转录病毒的RNA基因组包含一个包装信号（Ψ），这种信号可以引导病毒RNA封装到病毒粒子中，因此经工程改造含有Ψ的mRNA也将同样地整合到病毒粒子中。目前，首款使用Ψ将Cre重组酶mRNA整合到小鼠白血病病毒（MLV）颗粒中，重要的是该含有Ψ的mRNA经过额外修饰，使其不会被MLV逆转录酶作用，形成mRNA的瞬时递送，而不是将病毒cDNA稳定整合到转染细胞的基因组中。然而，每个病毒颗粒只能包装2个含有Ψ的RNA拷贝，还需要开发替代策略，使得VLP载体能包装更多mRNA。

为提升VLP的包装潜力，利用MS2衣壳蛋白（MS2cp）和MS2适配体（MS2apt）之间的相互作用，将mRNA直接包装进经过修饰的HIV-1病毒粒子中，用MS2cp替换HIV-1核衣壳蛋白的ZF2结构域，并在荧光素酶mRNA的3’端加入12个MS2apt拷贝，这使得每个VLP能够包装5-6个拷贝的荧光素酶mRNA。因此，在逆转录病毒衣壳蛋白中包含MS2cp、在mRNA中包含MS2apt，被认为是一种用VLP递送mRNA的潜在方法，已经有多个研究使用了这种MS2cp/MS2apt策略。

还有一种类似的将SpCas9的mRNA包装到HIV-1 VLP的系统mLP，将1个拷贝的MS2cp与HIV-1 gag-pol的N端融合，将6个拷贝的MS2apt加到SpCas9 mRNA的3' UTR。mLP在HEK293T、NIH3T3、K562和Jukat等细胞中都展现出较高的编辑效率，在小鼠单次视网膜下注射mLP成功介导RPE细胞中44%的VEGFa敲除，还成功使用装有SpCas9 mRNA和2个sgRNA的mLP通过同时靶向两种HSV基因来治愈小鼠的疱疹性角膜炎。

VLP包装递送Cas9 mRNA进行基因编辑的一大缺陷，是在sgRNA的递送上存在挑战，不经过化学修饰的gRNA会很快被降解，除非通过与Cas9蛋白络合而受到保护，因此在转染细胞中Cas9蛋白翻译合成前，VLP中的gRNA可能已经被大量降解了。尽管IDLV上编码的sgRNA能够通过Cas9 mRNA VLP进行有效编辑，但在转染细胞中仍以游离形势存在，如前所述尽管IDLV能够降低基因组整合的可能性、但仍然存在可被检测的整合，这使得此类方法存在一定风险。

5.2 VLP递送蛋白质或RNP

VLP包装蛋白质或RNP需要在VLP形成时，将目标蛋白定位在VLP中，为实现这一目的，可以将搭载物蛋白与病毒结构蛋白融合，包括在逆转录病毒gag多聚蛋白的不同位点，这可以在病毒衣壳自组装的过程中引导搭载物进入病毒粒子。多数情形下，gag和搭载物通过短肽序列相连，短肽在病毒成熟（搭载物被成功包装）后被一起封装的病毒蛋白酶切割，使得搭载物被释放到转染细胞中。

已有研究使用这种策略以VLP包装Cas9蛋白。例如，将SpCas9通过HIV-1蛋白酶的可切割接头与HIV-1 gag-pol的N端融合，用一起包装的慢病毒基因组表达sgRNA，这种结构在Jurkat细胞中实现14-28%的编辑效率；将SpCas9通过HIV-1蛋白酶可切割接头与HIV-1 gag的C端融合，用一起包装的慢病毒基因组或在VLP生产过程中用非慢病毒质粒来表达sgRNA，在Jurkat细胞中实现了高达90%的编辑效率、在原代人类T细胞中实现了高达70%的编辑效率，这比此前结果有了实质性的改善。

已有研究通过gag-Cas9的融合来用VLP包装RNP，被称为“纳米刀锋”，将SpCas9通过MLV蛋白酶可切割接头与MLV gag的C端融合，在VLP生产过程中用非病毒质粒来表达sgRNA，从而实现Cas9 RNP的包装。这种结构在HEK293T细胞中实现80-90%的编辑效率、在原代人类T细胞中实现30%的编辑效率、在原代人类HSPC中实现40%的编辑效率，且小鼠单次静脉注射纳米刀锋后在肝脏实现高达10%的编辑效率，首次验证VLP包装Cas9 RNP在体内基因编辑的有效性。

5.3 VLP递送的优势和未来展望

VLP递送基因编辑的主要优势在于，与质粒和病毒载体相比，VLP能最大程度降低脱靶风险。目前用VLP递送RNP已经能实现与VLP或LNP递送mRNA相当的编辑效率，而VLP-RNP递送的基因编辑药物暴露时间最短、因而脱靶风险较低，预计这有可能成为许多基因编辑应用的首选载体。

VLP对不同细胞的靶向性可以通过改变包膜糖蛋白来调节，为了进一步提供VLP递送的应用范围，需要进一步证明VLP可以递送到其他器官，这样可以充分发挥VLP作为一种可编程靶向性的mRNA/RNP瞬时递送载体的潜能。

VLP的大规模生产的可行性验证至关重要，如果能够扩大到更大规模临床前研究所需数量，则可以为VLP递送基因编辑在临床的应用铺平道路。

人类体内基因编辑的时代已经到来，CRISPR-Cas技术的广泛开发和优化孕育了用于基因编辑的强大工具，包括Cas核酸酶、Base Editor和Prime Editor等，将这些工具与有效的体内递送方法（包括病毒载体、LNP、VLP等）相结合，已经在从动物模型到人体临床得到了不同程度的概念验证。

目前的递送方式已经可以让基因编辑元件，通过静脉注射递送至肝脏细胞、通过眼内注射递送至眼睛细胞，因而眼下可以用于人体的基因编辑药物最可能先出现在治疗肝脏和眼部疾病。静脉注射靶向肝脏以外器官的基因编辑递送仍然充满挑战：天然存在和人工设计的AAV衣壳，对靶向CNS、骨骼肌、心脏等器官有较大前景；通过使用不同的包膜糖蛋白，VLP也有希望能实现靶向不同的细胞；虽然通过调整LNP配方来实现靶向不同细胞的机制尚不明确，但将靶向元件与LNP表面偶联的策略被证明十分有效。

对于每一种体内基因编辑的应用，很重要的是了解是否需要做到组织特异性、以及是否需要靶向肝脏以外的器官，能靶向特定组织的特定细胞类型有可能带来独特的治疗优势。重要的是，体内基因编辑应仅针对体细胞，并且必须始终避免生殖细胞编辑，否则会带来严重的伦理问题。

与基因编辑体内递送相关的免疫原性问题仍需进行全面分析，体内已存在的对递送载体的中和抗体有可能对基因编辑形成干扰，对Cas9或其他基因编辑元件的细胞免疫反应可导致转染细胞被清除，基因编辑在转染细胞中长期持续的表达也可能激活适应性免疫反应。虽然在没有已存在免疫的情况下，单次给药是有效的，但这种给药本身可能触发适应性免疫应答，使得重复多次给药很难有效。这些问题凸显了一次性、瞬时和高效递送的载体的重要性，例如LNP和VLP。

与长时间表达的递送方式相比，瞬时递送的另一个优势就在于能够降低脱靶的概率，在体内基因编辑中尤其重要，因为即使非常低频的脱靶在长期发生时也可能导致致癌突变。病毒载体通常能够产生较长时间的表达，就需要开发在完成编辑后关闭表达的方法，来减少脱靶；mRNA递送是瞬时的，并且脱靶概率较低；RNP因其暴露时间较短，而降低脱靶概率，目前看RNP如能实现有效递送则可能有很大影响力。

随着体内基因编辑疗法迅速走向临床，稳健的体内递送方案显得至关重要，未来递送的不断演进也将助力更加广泛的体内基因编辑应用，以及其他大分子药物的出现。

此部分非刘教授综述内容，由医芯君补充

外泌体递送载体

外泌体是磷脂双层囊泡，可以由大多数的细胞（包括B细胞、T细胞、DC细胞、巨噬细胞、神经元、胶质细胞、大多数肿瘤细胞和干细胞等）产生。外泌体的粒径在40~120nm之间。作为胞外小泡的一种，当多泡体与质膜融合时，外泌体被分泌到细胞外（下图）。最近，越来越多的证据表明，在生物体内遗传物质转移的自然途径中，外泌体可以在细胞之间传递丰富的物质。外泌体输送到受体细胞是介导细胞行为变化的关键步骤。此外，它们在细胞间通讯中也发挥着重要作用。由于这些特性，外泌体有望被用作药物和基因递送的载体。

 胞外小泡分泌过程

-01-外泌体：细胞间的转运体

外泌体于1983年首次在体外培养的绵羊红细胞上清液中发现且能被多种细胞分泌。最早外泌体被认为是细胞的“垃圾袋”，让细胞摆脱一些无用蛋白。

最近发现，外泌体所携带的的“货物”具有重要的生物学意义。外泌体具有多种生物学功能，包括T细胞的抗原呈递和细胞因子转运。在免疫中，外泌体负责抗原呈递和免疫反应的刺激或抑制。外泌体在免疫系统、神经系统和癌症中具有重要的生物学作用。最新研究主要集中在，多能干细胞和肿瘤细胞的外泌体上。在异位和原位肝细胞癌（HCC）模型中，发现肿瘤外泌体可以显著抑制肿瘤生长。因为HCC衍生的外泌体携带HCC抗原，它们可以触发DC介导的免疫反应。

-02-外泌体的药物递送优势

实现药物或基因的传递，重要的是载体类型。外泌体载体综合了细胞药物递送和纳米技术的优势。与细胞疗法相比，外泌体更容易储存，并且可以降低安全风险，可以从患者体液或细胞培养物中分离出外泌体，经修饰后转移回患者体内。

世界第一个外泌体 I 期临床试验表明了，大规模外泌体生产的可行性和外泌体给药的安全性。此外，运输功能性siRNA和miRNA以及蛋白质的外泌体还可能对许多疾病具有治疗前景。

外泌体的药物递送的几个优点：

外泌体在血液中表现出更高的稳定性，能够在生理和病理条件下在体内进行长距离传递。

外泌体具有亲水性核心，适合容纳可溶性药物。

外泌体是纳米级的，并携带细胞表面分子，具有克服各种生物屏障的能力，并且具有天然的靶向能力。

外泌体的免疫原性非常低。

越来越多的研究表明，外泌体药物是治疗人类疾病的一种有前途的方法。目前，最大的障碍是克服关于如何开发基于外泌体的药物制剂。以下我们讨论几种外泌体载药的方法。

▉孵化

将药物与外泌体结合的最简单方法可能是共孵育。将紫杉醇（PTX）与间充质干细胞一起孵育产生了负载PTX的外泌体，这些外泌体表现出显着的抗肿瘤作用。

▉电穿孔

在1000kV 电压下，电穿孔药物和外泌体的混合物5毫秒，成功地将药物装载到外泌体中。然而，这会加剧外泌体聚集的可能性。所以有必要确保外泌体均匀分散，以保证其在体内的功能，并增强其在储存期间的稳定性。

▉超声

处理药物-外泌体混合物。通过超声处理可以有效地将药物装载到外泌体中。考虑到大小、Zeta电位和载药量，超声处理后外泌体膜的结构和含量没有显著变化。此外，外泌体药物制剂在各种条件下保持了一个多月的稳定性。与其他纳米颗粒相比，载药的外泌体被大量吸收。它们还可以克服P-糖蛋白（P-gp）介导的药物外流，从而提高耐药肿瘤的治疗效果。

PTX外泌体制剂的表征

-03-外泌体的摄取和潜在靶向能力

外泌体起源于晚期内吞室，可扩散到细胞间液中。外泌体可以通过快速融合或内吞作用运送物质。当外泌体到达特定受体细胞后，外泌体表面分子与膜受体结合（包括细胞间粘附分子，淋巴细胞功能相关抗原1和TIM1）。最后，外泌体内容物被释放到靶细胞中。外泌体可能通过三种潜在机制被靶细胞吸收：

通过细胞膜的简单融合、内吞作用、通过特定表面配体激活靶细胞。外泌体中的一些蛋白质成分可能有助于形成保护性外壳以及稳定的囊泡结构，并可能携带靶向信息。

-04-外泌体用于药物递送系统的挑战

外泌体的一个关键问题是，如何获得高产量纯外泌体的。这主要是由于哺乳动物细胞释放的外泌体数量相对较低。此外，外泌体的纯化很麻烦。有几种方法可以从细胞培养上清液或生物液体（如牛奶、尿液、血浆、羊水、唾液和脑脊液）中分离外泌体（见表1）。这些方法各有优缺点。

表1：优缺点汇总

为了获得高产量的纯外泌体，第一，应该是拓展外泌体来源。第二，努力将细胞和纳米载体的特性结合起来。第三，能够增强装载各种货物的能力和靶向能力。因此，许多研究人员致力于开发合适的方法来修饰外泌体以装载药物或基因。

外泌体作为一个新的研究热点，由于体内分布的广泛性和获取的便捷性，已成为疾病诊断治疗的潜在有效方式，有着光明的前景。尽管，利用外泌体作为药物或基因递送载体仍处于起步阶段。我们相信，随着外泌体研究工作的深入，外泌体治疗可能最终药物或基因传递领域有重大突破。

声明：以上综述翻译内容来源于：1、基因编辑策略的内容来自 金斯瑞生物公众号 ，作者Aspen  ；  2-6递送载体内容来自  空之客公众号，作者令人愉悦的忧伤，感谢以上翻译者辛勤工作。

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