宾大研究团队解析LNP诱导血栓形成机制

脂质纳米颗粒(LNP)已成为生物制药行业中占主导地位的药物递送技术，有望递送RNA以上调或下调任何靶标蛋白质。

要实现将LNP靶向特定器官或细胞类型，目前常用两种已被研究验证的方法。较为传统的方式是将LNP与靶细胞表位结合的亲和基团（如抗体）偶联，但该方法存在生产可放大性和免疫原性上的问题，且目前还未有临床获批准的偶联LNP或脂质体。第二种方式依赖对大量LNP配方的筛选，通过不同的配方设计引入未知的理化性质以寻找具有“偶然”靶向嗜性的LNP配方。

目前的核酸药物研发生产中，通过改变LNP理化性质获得靶向性并进行筛选设计已成为实现药物特异性靶向的主要方法，其中LNP的可电离脂质成分被认为是决定LNP靶向性的关键成分。在LNP配方原4组分的基础上，研究者还通过添加其他带电荷脂质使LNP具有特定靶向性。据报道，带负电荷的脂质可将LNP定位到脾脏，带正电荷的脂质定位于肺部，实际研发生产过程中主要通过添加新的可电离脂质成分赋予LNP靶向性。

据研究显示，具有肺嗜性的LNPs经常会引起一个之前从未被报道过的副作用——血栓形成。现阶段的毒理研究实验主要关注在补体蛋白和免疫球蛋白两项血液防御系统上，而忽视了对血液凝血的影响。研究表明，血液会响应外来表面并发生主动凝结，其凝血级联反应会响应带电荷表面的刺激而激活。如果凝血激活不当甚至会产生致命的副作用。静脉注射带电荷纳米颗粒会使血液暴露于大量外来表面，还会通过与影响凝血过程的细胞（如中性粒细胞、血小板）相互作用间接激活凝血，因此我们需要重新审视静脉注射用纳米颗粒制剂所导致的血栓形成风险。

2023年7月25日，来自宾夕法尼亚大学的研究团队在预印本bioRxiv上发表了题为“Physicochemical Targeting of Lipid Nanoparticles to the Lungs Induces Clotting: Mechanisms and Solutions”的研究文章，首次解析了带正电的肺靶向LNP诱导凝血的详细机制，并针对该机制探究了可能的解决方案，在保持LNP出色靶向性的同时减少凝血风险。

在本研究中，肺靶向LNP配方采用了DOTAP，cKK-E12，DOPE，胆固醇和DMG-PEG 2000 五组分以50:25:5:18.5:1.5(mol/mol)的比例制备，文中标记为+DOTAP LNP。作为对照，非肺靶向LNP在没有DOTAP的情况下，用cKK-E12，DOPE，胆固醇和DMG-PEG 2000 以50:10:38.5:1.5(mol/mol)的比例制备，记为-DOTAP LNP（图1A）。

表征参数显示，两种LNP尺寸没有明显差异（-DOTAP LNP为99.22 ± 4.27nm，+DOTAP LNP为102.47 ± 0.48nm）（图1B），+DOTAP LNPs的zeta电位明显高于-DOTAP LNP(14.34mV＞-4.05mV)（图1C）。

图1. 肺靶向LNP的理化参数和在小鼠中引起的急性副作用表征

研究人员首先向每只小鼠静脉注射(IV) 10μg LNP-mRNA，并在注射后30分钟后处理进行解剖检查。研究人员发现，在接受+DOTAP LNPs的小鼠中，其肺部呈现红色和坚硬性状，类似于病理学描述的人类急性呼吸窘迫综合征(ARDS)的“肺肝样变”（肺组织呈肝脏样外观）（图1D）。

此外，研究人员还观察到+DOTAP LNP小鼠表现出明显的嗜睡和迟钝，注射后1小时内+DOTAP LNP小鼠行走的总距离比未处理小鼠少17倍，活动性明显下降（图1E）。

研究人员还通过测量IV+DOTAP LNP注射20小时后支气管肺泡灌洗液(BAL)的内容物来进一步评估肺特异性毒性，评估肺毛细血管渗漏情况。结果显示，IV+DOTAP LNP小鼠中，BAL蛋白和白细胞计数呈剂量依赖性增加（图1F，图2）。

图2. BAL血细胞计数呈剂量依赖性增加

考虑到肺靶向LNP通常用于治疗本身肺部存在病理改变的患者，因此研究人员在已存在肺部炎症的小鼠中进一步探究了+DOTAP LNPs是否造成更严重的副作用。研究人员通过雾化脂多糖(LPS)实现小鼠的急性肺部炎症，LPS暴露4小时后静脉注射+DOTAP LNPs，20小时后解剖小鼠。

与上一阶段实验一样，BAL蛋白浓度呈剂量依赖性增加（图1G），在10μg剂量下较未经LPS处理小鼠高出6倍。这些结果表明，+DOTAP LNP在预先存在炎症的条件下会造成更严重的毒性副作用。

为探究肺靶向LNP的毒性是否由凝血级联反应引起，研究人员采用了马森三色染色法(Masson’s trichrome)对小鼠肺切片进行染色。肺组织学样本显示，静脉注射+DOTAP LNP的小鼠在大血管和毛细血管水平上都显示出大的血液凝块（图3A）。这种影响不仅仅发生于肺部，颈动脉注射时也同样观察到大脑发生凝血。

图3. 肺靶向带正电LNP的凝血表征

除了前序实验中用DOTAP制备的LNP，研究人员还配置了具有各种可电离脂质（包括C12-200、ALC-0315、SM-102和DOTMA）的LNP以及脂质体。APTT（活化部分凝血活酶时间）测量结果显示，无论阳离子脂质类型如何，都耗竭凝血因子并引起APTT延长（图3G）。此外，在非LNP脂质体中也观察到了类似的APTT延长现象（图3H）。这些结果表明，含有阳离子脂质的带电荷脂质载体无论成分构象如何，都有引发凝血副作用的风险。

由于血小板聚集也会形成凝块，研究人员还评估+DOTAP LNP是否也会导致血小板的活化和聚集。测量注射+DOTAP LNP后30分钟抽取的血液中的全血细胞计数(CBC)，数值显示+DOTAP LNPs大大减少了雾化LPS处理后小鼠的循环血小板数量，在未处理小鼠中也显示血小板减少趋势（图4A）。循环血小板计数减少可能表明血小板因+DOTAP LNPs激活形成血液凝块而从循环中耗竭。

图4. +DOTAP LNPs引起血小板活化

研究人员进一步采用了流式细胞术对血小板活化程度进行了表征。如图4B所示，研究采用前向散射(FSC)和侧向散射(SSC)来检测更大和更复杂的血小板聚集体与小的分离血小板，并对血小板的两种特异性标志物（CD42d和P-选择素CD62p）进行染色。其中，CD42d存在于所有血小板表面，P-选择素储存在静息血小板中并在血小板活化时被释放。

在注射+DOTAP LNP的小鼠中，血小板的平均FSC和SSC值升高，表明血小板聚集体的形成（图4E，F）。此外，CD42d阳性事件的CD42d信号增加也表明+DOTAP LNP诱导了血小板聚集（图4G）。+DOTAP LNP诱导的P-选择素呈递增加20倍，进一步表明+DOTAP LNP诱导的血小板活化程度增高。

静脉注射后，LNP根据其理化性质可以形成独特的蛋白冠(Protein Corona)，并可能改变其功能，影响LNP的生物分布和特定细胞靶向。这些黏附在载体表面的蛋白质发生构象变化，其聚集行为也可能引起免疫原性和血栓副作用。

因此，研究人员探究了+DOTAP LNPs是否会与血浆中的凝血蛋白（如纤维蛋白原/纤维蛋白）结合。通常情况下，纤维蛋白原/纤维蛋白聚集可能导致血小板粘附和活化。纤维蛋白原在生理pH下具有净负电荷，并且含有高浓度带负电荷残基的结构域，因此可能会与带正电荷的LNP产生相互作用，造成凝血和血小板活化，聚集纤维蛋白原。

体外试验通过将荧光标记的纤维蛋白原和LNP添加到用肝素抗凝的血浆中进行了荧光跟踪分析。实验观察到，+DOTAP LNPs的纤维蛋白原阳性颗粒比-DOTAP LNPs多38倍（图5B-D）。

图5. 纤维蛋白原与+DOTAP LNP结合诱导血小板活化

肺切片的共聚焦显微镜图像显示+DOTAP LNP注射小鼠中纤维蛋白原的可见聚集体，而在-DOTAP LNP注射小鼠中没有可见的纤维蛋白原聚集。放射性标记纤维蛋白原实验显示，+DOTAP LNP使纤维蛋白原的肺摄取量增加约2倍，炎症小鼠中同样观察到肺摄取量的增加。这些数据均表明，纤维蛋白原会与+DOTAP LNP大量结合，且与肺部凝血相关。

在纤维蛋白原耗竭的血浆中，+DOTAP LNPs不会诱导显著血小板活化，证明纤维蛋白原是+DOTAP LNP诱导的血小板活化所必需的，带正电荷的脂质需要首先聚集并激活纤维蛋白原，才能激活血小板并进而激活凝血级联反应。

研究人员为探究抗凝药物是否可以降低+DOTAP LNPs的凝血毒性，设置比较了单独用+DOTAP LNPs处理小鼠和抗凝剂肝素(Anticoagulants Heparin)和比伐芦定(Bivalirudin)预处理的小鼠之间的血栓形成情况。研究人员发现，与单独注射+DOTAP LNP相比，肝素和比伐芦定预处理均可显著减少肺部血栓的形成（图6A）。

在确定抗凝能有效预防+DOTAP LNPs凝血副作用的基础上，研究团队进一步探究了抗凝治疗是否会对LNPs的生物分布和mRNA转染产生影响。研究采用了铟-111放射性标记LNP进行生物分布，并向小鼠注射荧光素酶mRNA的LNP追踪mRNA表达。

出人意料的是，使用肝素预处理的小鼠体内，其LNPs分布显著从肺部分散到肝脏和脾脏，且荧光素酶的表达也显著减弱（图6B,C）。研究人员推测，该现象很可能是由于肝素是带负电荷的多糖，与+DOTAP LNPs发生电荷相互作用，限制了LNPs的功能。相反，比伐芦定预处理小鼠其体内+DOTAP LNPs仍维持肺部特异性靶向，且荧光素酶表达未受影响。

图6. 抗凝治疗可改善+DOTAP LNP的副作用

介于直接凝血酶抑制剂比伐芦定的有效作用，研究者使用了直接凝血酶抑制剂PPACK偶联+DOTAP LNPs，并在小鼠体内验证了与比伐芦定类似的凝血抑制和LNPs功能维持的效果。与使用比伐芦定进行短暂抗凝治疗相比，PPACK偶联+DOTAP LNPs或是更好的临床解决方案（图7）。

图7. PPACK偶联+DOTAP LNPs

实验过程中，研究人员还发现+DOTAP LNP的尺寸大小与APTT呈正相关。LNP的尺寸从100nm增加到180nm时，APTT增加了约1.6倍；而LNP尺寸减小到80nm时，APTT恢复到初始水平，表明该尺寸下的LNPs没有激活内在凝血途径（图8A）。同样，80nm + DOTAP LNPs也没有显著激活血小板（图8B）。

图8. 减小+DOTAP LNP的大小可防止纤维蛋白原结合和凝血

通过对比100nm和80nm大小的+DOTAP LNP的纤维蛋白原摄取发现，100nm +DOTAP LNPs在肺中的纤维蛋白原摄取几乎是80nm的两倍，而80nm +DOTAP LNP组中无法检测到纤维蛋白原结合或纤维蛋白原聚集，因此该尺寸LNP不会激活血小板或纤维蛋白原聚集。小鼠肺部组织学样本进一步表明80nm +DOTAP LNP不会产生凝血块，且仍能保持肺部嗜性（图8H），证明减小+DOTAP LNPs尺寸可以有效减少血小板或纤维蛋白原聚集，减弱凝血副作用。

由于静脉注射带电荷LNP引起的血管内凝血导致急性血栓形成，凝血相关副作用有必要作为静脉注射纳米药物开发的研究标准之一。在早前LNP的研究中未发现凝血相关副作用可能源自体外测试LNP常使用去除凝血因子的血清而不是血浆。此外，研究过程中也经常会忽略血小板促血栓的关键作用，使毒性研究错过上游凝血机制引起的副作用。因此，有必要在体内体外评估纳米颗粒与参与凝血的无细胞和细胞成分的相互作用，尤其是在开发其他靶向方法的研究中需要评估该致命副作用。

目前研究开发中的许多LNP候选药物均针对癌症或炎症性疾病。基于本研究中小鼠已有炎症情况下，LNP会进一步导致更严重的肺损伤，因此需要更深入的机制研究和特定疾病状态的研究。

虽然仍需要在大型动物或人体上进一步研究LNP是否也会引起与小鼠模型相同的致命栓塞副作用，但凝血倾向在部分疾病中（如涉及凝血转移相关癌症）依然具有突出危险。