mRNA药物修饰及其递送系统研究进展

信使RNA；核酸；化学修饰；药物递送系统；纳米给药系统；RNA靶向；综述

mRNA 能直接编码目标蛋白质的翻译指令，利用细胞内蛋白质合成通路，具有瞬时表达的优势。与 DNA 不同，mRNA 不需进入细胞核，很大程度地避免了外源基因插入宿主基因的风险。mRNA 可以快捷地通过体外转录合成，通过表达各种功能蛋白可以实现过表达、激活、抑制和删除目的基因等目的。这使得 mRNA 药物具有高效、经济、作用时间快等特点，已成功应用于疫苗，并在肿瘤、心血管以及神经系统疾病的诊断和治疗方面展现了巨大潜力。

mRNA最初的研究集中在揭示mRNA结构和功能的关系、在细胞中的代谢，以及在各种疾病包括肿瘤中的应用。mRNA药物研究的重大突破是假尿苷替换尿嘧啶后显著降低了mRNA触发的免疫反应［1］，使外源导入的mRNA不易被免疫系统识别并清除。该研究为mRNA药物的体内应用奠定了基础，使mRNA药物进入临床研究成为可能。mRNA具有负电荷性质以及生物大分子属性，很难突破诸多物理屏障进入细胞质工作，因此不能直接被细胞摄取或注射给药。在促进mRNA稳定性和提高翻译效率方面仍有大量研究工作。纳米粒可以帮助mRNA分子避免核酸酶的降解，并改善mRNA的药代动力学。目前已经开发了多种纳米粒用于mRNA的体内外高效递送。

本文综述了mRNA药物的技术发展，讨论了提高 mRNA 稳定性和翻译效率的方法及设计原理，阐述了具有产业转换潜力的 mRNA递送系统的设计要求及其在疾病治疗中的应用，并展望了mRNA 药物未来可能的研究方向，以满足个性化精准医疗的需求。

研究表明，外源DNA和RNA会通过TLR激活固有免疫反应，然而两者对免疫系统的激活机制却大不相同。研究证明，DNA的CpG序列中胞嘧啶是否甲基化是触发免疫识别的结构基础［1］。对DNA而言，来源于细菌或病毒的未甲基化的CpG序列会激活TLR9，而来源于哺乳动物的甲基化的 CpG 序列却不能激活固有免疫反应［2］。对RNA而言，RNA分子中广泛存在核苷酸修饰，包括 m5C、m6A、m7G、肌苷以及 2´-O-甲基化修饰等，决定了免疫系统对宿主来源还是细菌或病毒来源的RNA做出反应，修饰核苷酸能降低RNA免疫原性。

哺乳动物细胞来源的rRNA比细菌来源的rRNA具有更多的核苷酸修饰，哺乳动物细胞来源的tRNA有高达25% 的核苷酸修饰，然而细菌来源的tRNA却未发现核苷酸修饰［1］。另外，宿主细胞还通过维甲酸诱导蛋白Ⅰ（一种经典的外源 RNA感受器）来识别来自细菌或病毒RNA分子［3］。已有研究发现体外转录合成的mRNA中包含 m5C、m6A、m5U、2-硫代尿苷，通过假尿苷修饰，能够消除TLR介导的免疫反应，与未经修饰的mRNA比较，树突状细胞在转导这些mRNA后，表现出更少的细胞因子释放以及更弱的免疫炎性反应［4］。进一步的研究表明，利用上述修饰的碱基替换原始尿嘧啶，不仅显著降低免疫原性，并且极大地增加了 mRNA 翻译效率。在细胞实验中，对比未化学修饰的mRNA，通过假尿苷修饰的 mRNA 可有高达 10倍的蛋白质表达。在小鼠实验中，假尿苷修饰的 mRNA 蛋白质表达更多和α干扰素激活更少［4］。N1-甲基假尿苷修饰的 mRNA 比假尿苷修饰的mRNA 有更多的蛋白质表达和更弱的免疫原性［5］。COVID-19 mRNA 疫苗也采用了 N1-甲基假尿苷修饰的mRNA［6-7］。以上研究为研发高效、安全的mRNA药物提供参考，为mRNA药物的临床应用奠定了基础。

通过体外转录合成的未经修饰的mRNA具有免疫原性，不能直接用于临床试验和治疗。通过假尿苷替换尿嘧啶合成的mRNA显著降低了mRNA对固有免疫系统的激活，增强了mRNA翻译。此外，为增强mRNA稳定性和提高蛋白质表达效率，通过密码子优化的方式重新编码mRNA，可显著增加mRNA翻译效率；修饰5´帽结构和3´多聚腺苷酸尾结构可增加mRNA稳定性；修饰5´和3´非翻译区可调控mRNA稳定性和翻译效率。mRNA的5´端和3´端非翻译区的化学修饰已经成为体外转录合成mRNA的标准流程。mRNA稳定性的提高和细胞内蛋白质的高表达奠定了mRNA药物临床试验和治疗的基础。图1展示了具有稳定性和高蛋白表达的mRNA所需的结构。

图1 具有稳定性和蛋白高表达的mRNA所需结构示意图。具有稳定性和高蛋白表达的mRNA所需的结构包括5´Cap、5´非翻译区、开放阅读区、3´非翻译区和3´多聚腺苷酸尾. AES：氨基末端分裂增强子；ARCA：抗逆转帽类似物；Cap：帽.

在翻译过程中tRNA通过转移氨基酸至核糖体进行蛋白质的生物合成。真核细胞中tRNA种类和数量、肽酰转移酶的表达量和活性、胞内氨基酸的浓度决定了tRNA在转运氨基酸的过程中具有偏好性。当外源DNA序列中编码了不常见密码子，且该mRNA所对应的tRNA表达丰度不高时，则导致外源mRNA具有较低的翻译效率［8-9］。研究表明，使用同义密码子替换不常见密码子所编码出的蛋白质能够保持蛋白质原始结构和功能，这在人类免疫缺陷病毒研究中取得了巨大成功，可以提高mRNA的稳定性和翻译效率［10］。另外，通过基因工程手段调整或者替换稀有密码子，使之成为频繁使用的密码子，可以大大提高非哺乳动物基因在哺乳动物细胞中的翻译效率［11］，但在进行密码子替换时需要匹配宿主细胞的tRNA偏好［12］。

除了采用密码子替换的方法来提高外源mRNA翻译效率，调控mRNA二级结构［13］、DNA序列中鸟嘌呤胞嘧啶含量［14］、序列中增强子顺式作用元件、内部核糖体识别位点［15］等，都可以调控mRNA的转录并影响蛋白质的表达。目前，很多软件程序的开发为DNA序列的优化提供了便利，并能直接影响对应mRNA的翻译效率。其中，Moderna公司和BioNTech公司研发的COVID-19 mRNA疫苗均采用密码子优化的方式获得mRNA，该序列编码一段全长的SARS-CoV-2 刺突糖蛋白并对K986p和V987p进行了突变以稳定刺突糖蛋白融合构象［16］。密码子优化显著提高了外源基因在宿主细胞的蛋白质表达，成为疫苗以及mRNA药物设计中关键的因素之一。

真核细胞中m7G是mRNA中广泛存在的5´帽结构，它通过一个三磷酸键连接 mRNA 5´端第一个核苷酸，称为帽 0（m7GpppN）［17］，帽 0结构对mRNA的翻译至关重要。mRNA的起始核苷酸2´O 位置额外的甲基化修饰为帽 1（m7GpppNm）修饰，帽 1 修饰降低了mRNA 体内应用引起的免疫反应［18］。mRNA 5´帽能调节前体mRNA的剪切、核导出、保护mRNA不被核酸酶降解并决定蛋白质翻译的启动［19］。

mRNA 5´帽修饰包括转录后加帽和共转录加帽［20］。转录后加帽的修饰是通过牛痘病毒帽酶［21］，将帽 0 添加到体外转录合成的 mRNA，然后通过牛痘病毒2氧甲基转移酶将帽0转化为帽1结构［21］，尽管该方法能达到100%加帽效率，但在加帽前需要将mRNA纯化和质检，导致过程烦琐和成本过高的问题［22］。共转录加帽的修饰可通过一步法完成，这是目前主要的帽修饰方式，通常 5´帽在体外转录时加至mRNA，但研究发现共转录加帽修饰mRNA是个可逆的过程，这导致加帽效率降低［23］。

ARCA已广泛应用于 mRNA的体外转录合成。研究发现，在培养的细胞中，ARCA修饰的mRNA相比未被修饰的mRNA具有更长的作用时间和更稳定的蛋白质表达［21，24-25］。为解决第一代 ARCA 低反应产率及低加帽效率，随后的研究开发了新的 5´帽抗反向帽类似物 CleanCap，能够在“一锅法”酶催化反应中产生94%帽1 mRNA产物和高达5 mg/mL体外转录反应产率［26］。5´帽结构对mRNA 转录起始以及mRNA稳定性都至关重要，越来越多的帽结构类似物的发现将极大地促进 mRNA 药物的发展。

3´多聚腺苷酸尾结构能够显著增加mRNA的稳定性，并延长mRNA 寿命［27］。一般认为，3´多聚腺苷酸尾通过结合多聚腺苷酸尾结合蛋白，促进mRNA环形结构的形成并增加mRNA翻译效率［28］。3´多聚腺苷酸尾还能与5´帽协同作用，调节 5´去帽和 3´去多聚腺苷酸尾过程，进而调节mRNA的稳定性［29］。mRNA的细胞质内降解是从多聚腺苷酸尾变短开始的，多聚腺苷酸尾首先缩短成10~12 nt的长度，然后触发5´去帽过程，进而诱导mRNA降解［30］。

在哺乳动物细胞中，3´多聚腺苷酸尾广泛存在于 mRNA，并随着时间推移多聚腺苷酸尾的长度逐渐变短［31-32］，活跃翻译的mRNA通常含有 100~250 nt 长度的多聚腺苷酸尾［33］。mRNA的3´多聚腺苷酸尾通常来自mRNA转录的DNA模板，可通过体外转录一步法得到长度可控的多聚腺苷酸尾。另外一种方法是通过在体外转录合成的mRNA中加入多聚腺苷酸尾聚合酶从而添加多聚腺苷酸尾。目前该反应可通过商业化试剂盒轻松添加超过100个左右的核苷酸多聚腺苷酸尾。由于多聚腺苷酸尾的长度依赖mRNA中 3´羟基、多聚腺苷酸尾聚合酶和三磷酸腺苷的浓度，该加尾反应的缺点是对不同mRNA多聚腺苷酸尾添加长度不可控。一般来说，体外转录合成的mRNA中多聚腺苷酸尾的最佳长度是包含100个左右核酸［34］，但也有研究表明高度活跃翻译并且稳定的mRNA通常具有较短的多聚腺苷酸尾长度（30 nt）和更好的蛋白质表达效率［30］。相反，低翻译效率的mRNA具有较长多聚腺苷酸尾长度［30］。

mRNA 5´非翻译区含有翻译调控元件，通过与RNA结合蛋白相互作用调控mRNA稳定性、核糖体识别、mRNA二级结构，很大程度上决定了蛋白质表达效率［35］。3´非翻译区通常影响mRNA的寿命［36］。BioNTech公司研发的 COVID-19 mRNA疫苗，其 5´非翻译区来自含有优化科扎克序列的人α-球蛋白 RNA，能够促进转录前起始复合物和核糖体定位在转录起始点，其 3´非翻译区由两个序列元件组成，该序列元件来源于分裂mRNA 的氨基末端增强子和线粒体编码的 12SrRNA，其含有miRNA结合位点，能够延缓mRNA降解，延长mRNA寿命［37］。另外，体外转录合成mRNA过程中，来自人α和β球蛋白3´非翻译区元件常被添加到mRNA中以增加mRNA的稳定性和翻译效率［38］。

mRNA发挥治疗作用需要达到特定细胞并表达出足够多的蛋白质。由于mRNA具有负电荷以及生物大分子的属性，mRNA不能直接作用于细胞或进行注射，这就需要安全高效的递送系统帮助mRNA免受核酸酶降解并增加细胞摄取和增加内涵体逃逸。目前已经研发出多种mRNA递送系统，包括脂质纳米粒、聚合物纳米粒、无机纳米粒以及基于蛋白质的类病毒纳米粒（图2）。其中，脂质纳米粒具有安全性和高效性，目前COVID-19 mRNA疫苗均采用脂质纳米递送技术（附表 1）。另外，为降低mRNA药物剂量以及减少毒副作用，通过在纳米粒表面修饰靶向分子，可以与组织或细胞的受体特异性识别和结合，从而增加mRNA对特定组织或细胞的有效递送。

图2 具有代表性的mRNA递送系统示意图

脂质纳米粒通常由可电离脂质、辅助脂质、胆固醇或其类似物、聚乙二醇脂构成。各个组分不同的比例决定了脂质纳米粒稳定性和mRNA递送效率。

可电离脂质是脂质纳米粒中用来结合mRNA的组分，通常含有至少一个叔胺头部结构和疏水的烷基链结构。该结构随着溶液 pH 值的变化发生电荷的变化，在酸性溶液中能结合氢离子带正电并与带负电荷的mRNA结合，在中性环境下不带电，形成稳定的脂质纳米粒。该结构对内涵体逃逸和mRNA的细胞内释放至关重要。

在制备脂质纳米粒的过程中，通常将mRNA溶解在pH 4~5的酸性溶液中，并加至含有脂质的有机相中。该过程的酸性溶液有助于可电离脂质与mRNA相互作用形成复合物。随后，在中性缓冲液透析除去有机相的过程中，溶液pH值的变化以及亲水疏水相互作用促使复合物体系形成稳定的包裹mRNA的脂质纳米粒。当脂质纳米粒被细胞摄取后，在内涵体酸性环境中，可电离脂质纳米粒中的叔胺键质子化，与负电荷的磷脂形成两性离子，并与疏水烷基链组装成锥形结构，该结构有助于六方晶相的形成，可使内涵体膜破裂，促进mRNA胞内释放［39］。

目前已经开发出多种可电离脂质，如可电离化的阳离子脂质 DLinMC3-DMA已成功用于siRNA药物Patisiran中［40］。DLin-MC3-DMA的不可降解性增加了其潜在的毒副作用；而可降解脂质L319能增加其生物降解性和RNA的释放［41］。目前mRNA疫苗均采用了可降解脂质，例如SM-102用于Moderna公司mRNA-1273疫苗［42］，ALC-0315用于BioNTech公司BNT162b2疫苗［43］。

尽管可电离脂质在 mRNA 的递送系统中发挥重要作用，辅助脂质对于递送以及 mRNA内涵体释放也很重要。含有不饱和键的辅助脂质相较于含有饱和键的脂质具有更好的mRNA递送能力和蛋白质表达能力［44-45］。例如磷脂所含的不饱和键在酸性内涵体中更容易形成六方晶相，促进膜结构破裂，导致mRNA胞内释放［46-47］。

胆固醇具有稳定脂质纳米粒的功能。其贯穿脂质纳米粒膜结构，并影响纳米粒与细胞的相互作用［48］。有研究表明，内吞循环会导致脂质纳米粒被细胞吐至细胞外，而NPC1介导的内吞循环是导致脂质纳米粒核酸递送效率较低的关键因素［49］。NPC1通过识别胆固醇并将其外排至细胞外以确保细胞胆固醇稳态［50］；相较于胆固醇，羟基胆固醇与NPC1具有不同的结合力，导致NPC1介导的脂质纳米粒外排减少［51］，羟基胆固醇制备的脂质纳米粒具有较高的T细胞转染效率，可为 T 细胞的工程化以及T细胞治疗提供重要技术手段［51］。

同样，聚乙二醇脂对脂质纳米粒的半衰期以及稳定性有重要的影响［52］。聚乙二醇分布在脂质纳米粒表面，可阻止血液中蛋白质的吸附和巨噬细胞的摄取，以提高纳米粒的血液循环［53-54］。聚乙二醇还可进行功能化修饰，使之能够靶向特定组织和细胞。例如通过化学键偶联抗体修饰聚乙二醇并制备脂质纳米粒可靶向T淋巴细胞从而实现T细胞重编程［55］。由于载脂蛋白E吸附是介导脂质纳米粒肝脏靶向的重要原因［56］，通过聚乙二醇化学修饰来阻止载脂蛋白E吸附是非肝靶向递送系统设计的重要研究方向。

聚合物纳米粒主要通过含有正电荷的阳离子聚合物压缩具有负电荷的mRNA形成纳米粒。常用的阳离子聚合物有聚乙烯亚胺［57-58］、聚赖氨酸［59-61］、树形高分子Dendrimer［62-63］等。然而，由于阳离子聚合物一般分子量较大，其正电荷通常会造成额外的细胞毒性，限制了这类阳离子聚合物的进一步应用。这类阳离子聚合物需要进行功能化修饰以增加 mRNA 递送能力并降低毒副作用。

研究发现，通过氧化石墨烯修饰的聚乙烯亚胺将 mRNA成功递送至多能干细胞，显著提高了重编程效率，并成功地从人脂肪组织来源的成纤维细胞生成了大鼠和人多能干细胞，而无须多次重复转染［64］。然而，考虑到高分子量聚乙烯亚胺的不可降解性以及毒性，利用低分子量聚乙烯亚胺（分子量为 1800）修饰维生素E琥珀酸酯，并结合mRNA自组装形成纳米聚合物囊泡，与高分子量聚乙烯亚胺（分子量为 25 000）比较，该聚合物囊泡展示了较高的 mRNA 转染效率和较低的毒性。动物试验表明，通过肌内注射给药，该纳米囊泡包裹 SARS-CoV-2 mRNA可诱导强劲的抗体反应，同时并没有观察到明显的毒性［65］。

聚赖氨酸由于其安全性和可降解性被广泛用于核酸递送系统的研究［59-61］。然而，在结合核酸形成纳米囊泡后，缺乏稳定性一直是限制其进一步发展的主要障碍。研究表明具有灵活可变结构的聚电解质比具有刚性结构的聚赖氨酸更容易结合mRNA，并具有更好的mRNA递送效率［60］。Miyazaki等［60］合成聚乙二醇-PGBA，该结构具有灵活可变的聚醚骨架，相比具有刚性聚酰胺骨架的聚乙二醇-聚赖氨酸，聚乙二醇-PGBA能够促进其结合的mRNA复合物中水的释放，导致该复合物具有较低自由能和更好的稳定性。在尾静脉注射后，聚乙二醇-PGBA 结合的mRNA复合物相比聚乙二醇-聚赖氨酸结合的mRNA复合物血液循环时间更长。此外，研究人员进一步合成了聚乙二醇-PGMG，结果发现共聚物结构中的胍基能够与mRNA中的磷酸形成多共价相互作用，这对促进复合物稳定以及mRNA的转染具有积极的影响［66］。

由于聚 β 氨基酯具有可降解性和模块化的合成手段，成为有前景的核酸递送材料。其促进核酸释放的机制是聚 β 氨基酯在内涵体酸性环境中质子化，通过改变内涵体渗透压导致细胞膜结构破裂，进而促进核酸释放［67］。聚 β 氨基酯因为其中酯键具有水解作用，所以安全性优异［68-69］。目前，聚β氨基酯用于递送编码CAR的DNA而用于肿瘤治疗［70］。在递送 mRNA方面，含有阳离子的聚β氨基酯通过静电作用结合mRNA形成带正电荷的复合物，再通过静电相互作用包裹含有靶向分子CD8抗体修饰的负电荷聚谷氨酸，形成具有靶向T细胞能力的纳米粒。该纳米粒具有可冻干保存的优势，且再次溶解后，其转染 mRNA 及靶向递送能力没有明显变化。该纳米粒能够靶向体内循环 T 淋巴细胞，可用于递送体外转录合成的编码 CAR-T细胞受体的mRNA，并在体内产生足量的工程化CAR-T细胞，实现了抗肝脏肿瘤治疗效果［70］。

阳离子聚合物纳米粒在核酸递送方面潜力巨大。合理设计阳离子聚合物需要考虑多方面因素。为有效结合核酸，阳离子聚合物通常要求具有较高的正电荷密度。在细胞摄取后为增加内涵体逃逸以及核酸释放，阳离子聚合物要求含有叔胺结构以增加质子缓冲效应，同时要求分子链结构中有疏水片段以有效促进纳米粒的形成［71-72］。目前发展起来的聚合物模块化合成已考虑这些因素的影响，这对设计高效的核酸递送聚合物纳米粒意义重大。然而，过多的正电荷密度可能造成潜在的细胞毒性，以及无法预测聚合物链中各个模块的最佳比例，这是设计、合成一款性能优异的用于核酸递送的聚合物面临的挑战。此外，由于某些类型的细胞对纳米粒的摄取具有尺寸选择性［73］，因此还需要考虑聚合物在结合核酸后形成纳米粒的大小。目前尚难以在上述几方面达到平衡。尽管目前研发的阳离子聚合物具有优异的核酸递送能力，然而其临床转化仍面临不小挑战。未来可以利用机器学习及人工智能预测具有高效核酸递送能力的聚合物纳米粒，即利用海量的阳离子聚合物/核酸复合物的研究数据，为下一代生物相容的具备高效递送能力的、具有临床转化潜力的聚合物设计提供参考。

相较于聚合物纳米粒，无机纳米粒具有合成简单、生物安全性好、毒理研究较为清楚、可进行表面功能化且尺寸可控等优势。其中，金纳米粒因其稳定的结构、优异的安全性，以及其在近红外光辐照下的离子共振特性等被广泛用于DNA［74］、siRNA递送［75］和光响应生物医学研究［76-77］。已有研究者利用树形高分子修饰的金纳米粒进行了胞内 mRNA 递送的研究［62］。该纳米粒能够保护mRNA免受核酸酶的降解，经叶酸修饰后能够靶向叶酸受体表达的肿瘤细胞并促进mRNA的释放和表达。

除了金纳米粒，Liu等［78］探索了利用聚乙烯亚胺修饰的石墨烯量子点来递送mRNA。由于石墨烯量子点具有良好的分散性、生物安全性以及巨大的表面积，在小分子药物递送以及核酸递送中备受瞩目。通过修饰不同比例的聚乙烯亚胺调节石墨烯表面电荷并用于绑定mRNA，形成的mRNA复合物能够递送功能性 mRNA 至 Huh-7 肝细胞并能够表达出蛋白质。该研究对利用石墨烯递送功能 mRNA 进行了概念验证，提出了一种稳定高效递送mRNA的新方法。

硒是一种非金属材料，是人体必需和植物有益的营养元素。硒纳米粒具有安全性和可降解性，因此被用于 DNA 递送等研究。Maiyo等［79］尝试利用硒纳米粒递送 mRNA。通过壳聚糖修饰硒纳米粒结合mRNA，并接枝叶酸用于靶向叶酸受体高表达的肿瘤细胞。该纳米粒对不同的癌细胞表现了不同的毒性，提示硒纳米粒与这些癌细胞具有不同的相互作用。

尽管这些无机纳米粒展示了优异的核酸递送能力，但mRNA是通过暴露在这些纳米粒表面进行递送的，导致其较低 mRNA 装载率。为克服这个问题，Wang等［80］报道了多功能硅纳米粒，其具有高 mRNA封装率、小尺寸（水合半径小于50 nm）、多样性的表面修饰能力、优异的生物相容性、高效的内涵体逃逸和释放特性，以及拥有谷胱甘肽还原响应等特点。硅纳米粒经尾静脉注射可以递送mRNA及核糖核蛋白至视网膜色素内皮细胞，具有高效的蛋白表达和基因编辑能力。鉴于硅纳米粒的安全性，该研究为高效安全的核酸治疗及基因编辑提供了一种新的多功能递送平台。

一些无机纳米粒自身具有优异的生物性能，通过递送治疗性核酸，可与核酸协同相互作用应用于疾病的治疗。其中，代表性材料黑磷是一种非金属半导体材料，其在整个可见光范围内具有生成活性氧的性能，可应用于光热［81］和光动力学治疗［82］。此外，黑磷很容易氧化并降解为亚磷酸盐以及磷酸盐，因此具有优异的生物安全性，可应用于 siRNA 等治疗性核酸抗肿瘤研究［83］。最近一项研究表明，黑磷可直接影响细胞周期的中心体，诱导细胞凋亡，其机制是黑磷与细胞中心体激酶Plk1结合并诱导其聚集，阻止了Plk1的迁移和在中心体的激活，最终导致细胞多级纺锤体形成，并造成有丝分裂延迟［84］。这提示黑磷具有强大的抗癌活性，为无机纳米材料递送核酸的研究提供了范例。鉴于黑磷纳米粒的mRNA递送潜力，并通过mRNA与疾病发生、发展过程中的关键通路相互作用，发展具有生物活性的mRNA递送载体无疑是有应用前景的研究方向。

借助病毒衣壳蛋白颗粒包裹mRNA实现细胞间通信，并传递功能性mRNA是一全新的mRNA递送手段。由于慢病毒几乎可以高效感染任何细胞，而mRNA可以与噬菌体衣壳蛋白特异性结合。与使用活病毒不同，利用衣壳蛋白递送mRNA在安全性上更具优势。Ling等［85］ 通过病毒工程技术，研发了新的mRNA递送系统VLP-mRNA。该系统可同时递送mRNA和gRNA，在体内实现了强大的基因编辑效果，且未检测到明显的脱靶效应。与腺相关病毒载体比较，VLP-mRNA只有 72 h 的编辑窗口，避免了 CRISPR-Cas9 在体内与患者的长期共存。同时VLP-mRNA具有低免疫原性，体内外试验均未检测到该系统引起的免疫反应［85］。总之，VLP-mRNA 系统突破了传统病毒载体包装能力小的限制，并具有低脱靶性和优异的安全性，是体内基因编辑的强大工具。

Segel等［86］报道了利用小鼠和人类逆转录转座子衍生蛋白质PEG10实现了包裹、分泌和递送特定RNA的研究。该研究首先鉴定了具有潜在递送核酸能力的基因，发现其编码的PEG10最为丰富且能形成病毒样颗粒。PEG10 结合 RNA 依赖核衣壳和逆转录酶，并且需要在外源病毒包膜蛋白的帮助下才能有效包装、传递和翻译 mRNA。为了使该系统内源化以消除免疫原性，研究者使用内源融合蛋白替换外源病毒包膜蛋白，并对该系统进行优化，实现了递送不同的 mRNA 至神经母细胞瘤细胞系中，产生了约60%的基因插入和缺失。该研究中，内源PEG10系统解决了由纳米粒递送mRNA带来的免疫原性问题，极大地扩展了mRNA递送治疗的研究范畴。

另外，由Entos Pharmaceuticals公司开发的蛋白脂质载体核酸递送载体能够通过膜融合方式直接递送核酸，使mRNA进入细胞质，绕过内吞途径，从而实现高效的核酸递送［87］。蛋白脂质载体由耐受性良好的中性脂和膜融合相关的跨膜蛋白质FAST蛋白组成，能够促进高效的膜融合和治疗性核酸等有效载荷在细胞内传递。

利用内源性蛋白质或病毒衣壳蛋白进行核酸递送，展现了新一代核酸递送材料研究的重大进步。这将在很大程度上解决递送系统免疫原性的问题。相较于纳米粒，这些类病毒纳米粒具有相对高效的递送能力和包裹能力，包括递送CRISPR-Cas9 mRNA等长链mRNA。与广泛使用的病毒载体比较，这些新型的类病毒纳米粒在安全性和免疫原性方面具有优势。虽然该技术仍需进一步验证其可靠性，其大规模生产以及质量控制仍有待进一步研究，但这些递送技术进一步拓展了细胞生物学的研究领域，并在眼科疾病、神经系统疾病以及体内基因编辑研究领域具有重要价值。

mRNA药物在基因治疗领域展现了巨大的潜力和应用价值。通过纳米技术手段能够将高度不稳定的mRNA进行有效的细胞内递送，促进目标蛋白质的瞬时高表达，实现异常蛋白质的功能补偿和修复。通过细胞内递送CRISPR mRNA，还能实现靶基因的激活、抑制和敲除，极大地丰富了基因治疗的手段和范围。mRNA疫苗的成功研发促进了 mRNA 作为药物在多个疾病治疗领域如肿瘤、病毒感染、心血管疾病以及神经系统疾病中的应用［88-91］。

mRNA的化学修饰极大地提高了mRNA的稳定性以及翻译效率，并显著降低其免疫原性。纳米递送技术的发展促进了 mRNA药物的成功，并在一定程度上解决了 mRNA 临床应用面临的挑战。纳米粒保护 mRNA不被核酸酶降解，改善其血液循环和药代动力学，有助于 mRNA进入细胞和内涵体逃逸。尽管脂质纳米技术代表了mRNA药物递送的巨大成功，然而该技术仍面临挑战，需要进一步改进。例如构成脂质纳米粒的必要成分聚乙二醇可引起免疫反应，研究表明肌内注射聚乙二醇修饰的 COVID-19 疫苗（BioNTech公司研发）后，在血液中发现了抗聚乙二醇IgG、IgM和IgE抗体，并在肌内注射3周后发现抗聚乙二醇IgG浓度升高［92］。尽管没有发现严重的副作用，但抗聚乙二醇抗体的产生可能会减弱需要多次mRNA脂质纳米粒给药治疗效果。

另外，有研究发现，mRNA脂质纳米粒不但不会缓解，反而会加重细菌性肺炎的进程［93］。为提高mRNA脂质纳米粒治疗效果，提高 mRNA的靶向递送是递送系统设计需要重视的关键技术之一，如降低mRNA以及脂质纳米粒的剂量，增加病灶组织的积累，减少健康组织器官的脂质纳米粒暴露，是mRNA脂质纳米粒靶向递送重要的发展方向。目前已经开发了多种组织特异性靶向递送技术，例如通过修饰包括靶向肽［61］、抗体［55，70］、适配体［94］等靶向分子，但是肝脏仍然是脂质纳米粒主要聚集器官。通过调整脂质纳米粒内外部电荷实现特定器官的 mRNA递送［95］，以及通过调整脂质纳米粒中可电离脂质氨基头部结构实现肺部特定细胞亚型mRNA递送［90］，这些均是靶向mRNA递送的重要研究进展。提高特定细胞类型的mRNA靶向递送仍是充满挑战的重要研究方向。

探索mRNA与细胞的相互作用来实现mRNA的高效递送仍是最前沿的研究课题，mRNA在免疫、炎症等关键生理过程中扮演的角色仍有许多未解之谜。为实现有效的临床转化，需要继续发展能提高 mRNA稳定性和高蛋白表达的技术，以及先进的纳米递送策略。整合最新的纳米技术，通过高通量筛选、大数据以及人工智能等先进技术开发下一代智能靶向 mRNA递送系统，不仅对治疗性核酸的递送有积极作用，而且对推动基因疗法在疾病治疗领域的应用具有重大意义。