基于脂质载体的mRNA疫苗递送系统研究进展

正文

传染病是造成人类过早死亡的重要原因之一，在过去几个世纪，天花、霍乱和流感等传染病的全球大流行威胁着全人类的健康安全。近年来，新型流行性病毒感染阶段性出现，包括寨卡病毒（Zika virus，ZIKV）、埃博拉病毒（Ebolavirus，EBOV）、严重急性呼吸系统综合症冠状病毒（severe acuterespiratory syndrome coronavirus，SARS-CoV）和中东呼吸综合征冠状病毒（middle east respiratory syndrome coronavirus，MERS-CoV）等［1］。疫苗的出现为预防及治疗传染性疾病带来了希望，已经通过接种天花疫苗彻底消灭了天花病毒，流感病毒和埃博拉病毒疫苗均已获批上市［2-3］。目前被广泛研究的传统疫苗有4种，灭活疫苗、病毒载体疫苗、重组蛋白疫苗和减毒活疫苗［4］。但是传统疫苗存在研发周期长，制备困难和易引起二次感染的缺点，所以新型疫苗研发备受关注。最近，核酸疫苗的兴起，特别是针对转录信使RNA（mRNA）疫苗的深入研发让人们看到了未来疫苗的前进方向［5］。

mRNA具有安全有效的蛋白质表达谱，在遗传病新疗法、表达功能性蛋白和抗体、疫苗或基因编辑的开发上具有良好的应用前景。mRNA疫苗是核酸疫苗中RNA疫苗的重要组成类别，递送过程中使其到达细胞质即可发挥作用，而同属核酸疫苗的DNA疫苗只有到达细胞核才能发挥疗效，所以mRNA疫苗预防及治疗效率更高。并且相较于传统疫苗，mRNA疫苗在安全性、有效性、以及能够快速大规模生产方面更具有优势［6］。然而，基于mRNA疫苗的临床应用，由于其稳定性和传递效率低下而受到限制。近年来，脂质类材料及其衍生物因其优良的生物相容性以及对mRNA较好的包封率而被广泛研究应用于mRNA疫苗的体内递送［7］。

本文以“mRNA疫苗”递送问题为出发点，结合国内外学术界对全球突发新型冠状病毒肺炎的研究，对“脂质载体”递送mRNA疫苗的递药系统构建及研究进展进行了较为系统的综述，旨在使生物医学研究人员和临床工作人员更全面的了解脂质疫苗递送系统，以期在mRNA疫苗方面获得更大的成功。

当外来mRNA被递送到细胞质中时，能够被TLR3和TLR7/8识别，或者通过激活细胞质中的维甲酸诱导基因Ⅰ样受体（RIG-I-like receptors，RLRs）从而激活天然免疫系统［12-13］。同时，外来的mRNA还可以通过激活TLRs诱导干扰素（IFN）-α和IFN-β等Ⅰ型干扰素等促炎细胞因子的表达［14-15］。所以，合成的mRNA疫苗可以通过激活不同的细胞因子来促进mRNA免疫后的细胞或者体液反应，从而作为良好的自佐剂。但是胞内免疫也会限制mRNA发挥作用，TLR家族中的模式识别受体（pattern recognitionreceptors，PRRs）、RLRs和NOD样受体（NOD-likereceptors，NLRs）能够特异性检测双链mRNA（ssRNA）或者单链mRNA（dsRNA），并且能够在它们转化为有治疗作用的蛋白质之前使其降解。

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脂质体是当两亲性的磷脂分散于水相时，分子的疏水尾部倾向于聚集在一起，避开水相，而亲水性的头部暴露在水相，从而形成具有双分子层的封闭囊泡。近年来，关于利用脂质体递送mRNA疫苗的技术越来越成熟。DOTAP是一种含有单不饱和脂肪酸的阳离子磷脂，制备成本相对较低，并且具有较高的mRNA递送效率，因此成为该领域被广泛研究的阳离子脂质载体［29-30］。为了增强载体对mRNA的运载能力以及提高mRNA的稳定性，研究人员多数情况下会对脂质体进行一些修饰。Zohra等［31］用对核酸具有强亲和力的无机晶体-碳酸盐磷灰石修饰了基于DOTAP的脂质体载体，发现其转染率比对照组高5～15倍。Zhang等［32］研究制备了胆固醇修饰的阳离子肽DP7，并且用它来修饰DOTAP脂质体进而制备出了具有双重功能的递送系统，该系统既可以作为mRNA的载体将mRNA有效地递送到不同的树突状细胞（dendritic cell，DC）中去，又可以作为免疫佐剂刺激DC成熟，证明该系统是一种非常有前景的mRNA疫苗的递送系统。

鱼精蛋白是一种存在于鱼类成熟精子细胞核中的碱性蛋白质，能够应用于将mRNA凝聚成纳米复合物，以提高mRNA稳定性和载体包封率。Mai等［21］利用鱼精蛋白修饰阳离子脂质体，制备了阳离子脂质体/鱼精蛋白复合物（LPC），体外摄取实验证明，LPC在摄取mRNA疫苗方面显示出更高的效率，并且具有更强的刺激树突状细胞使之成熟的作用，从而诱导了有效的抗肿瘤免疫应答。在Lewis肺癌模型中，LPC携带编码细胞角蛋白19（cytokeratin 19）的mRNA通过鼻腔给药的方式，引起了强烈的细胞免疫反应并延缓了肿瘤的生长。Zhang等［22］用鱼精蛋白对脂质体进行修饰，制备了鱼精蛋白脂质体（CLPP），用来携带编码Survivin-T34A基因的mRNA，形成了一种新型的核壳结构纳米粒制剂（CLPP/mSur-T34A），结果表明该制剂在体内外对各种C26结肠癌模型均有明显的治疗作用。

甘露糖也能作为脂质体的修饰材料对mRNA的递送起到一定的效果。Wang等［33］以不同PEG单元为连接物，合成了甘露糖-胆固醇结合物（MPN-CHS），并将其制备树突状细胞靶向脂质体（MPN-LP），最终制备了携带mRNA的MPN-LPX（MPN-LPX）。体外转染DC实验表明，甘露糖衍生物的PEG长度对GFP编码mRNA的表达有显著影响，含有MP1000-CH的MP1000-LPX的转染效率最高（52.09±4.85）%。此外，MP1000-LPX对血清中mRNA的降解有保护作用，效果显著。

越来越多的研究表明了各种脂质纳米粒（Lipid nanoparticles， LNPs）在mRNA疫苗治疗中的潜力［34-35］。LNPs由胆固醇（有助于稳定）、天然磷脂（支持脂质双层结构）、PEG衍生物（减少聚集和非特异性摄取）和可电离脂质（复合带负电mRNA、增强内体逃逸）组成。Oberli等［36］报道了一种脂质纳米颗粒制剂，该制剂用于运送mRNA疫苗，以诱导细胞毒性CD8+T细胞反应。用含有编码肿瘤相关抗原gp100和trp2的mRNA的脂质纳米粒治疗B16F10黑色素瘤，导致肿瘤缩小，并延长了治疗小鼠的总生存期。显示出该脂质纳米粒是一种有希望的mRNA疫苗载体，能够诱导强烈的细胞毒性T细胞反应。Kauffman等［37］采用脂质纳米颗粒来载送mRNA并通过处方优化，改变了可电离脂质与mRNA的配比，使得促红细胞生成素mRNA的负载效力提高了7倍。Richner等［38］设计并测试了一种改良的基于mRNA的ZIKV疫苗。采用源自递送小干扰RNA（siRNA）的改进技术将该疫苗组装成了脂质纳米粒（LNP），并评估该疫苗在免疫低下的AG129小鼠和免疫活性C57BL/6小鼠中的效果。结果显示，经肌内注射10 µg LNP的动物第21天加强免疫后血清中和抗体水平较高，并且接种ZIKV疫苗42 d后，在没有体质量减轻的情况下小鼠100%存活。

脂质-聚合物杂化纳米粒（lipid-polymerhybrid nanoparticles，LPNs）是包含聚合物内芯和脂质壳的纳米粒子结构，在物理稳定性和生物相容性方面具有聚合物纳米粒子和脂质纳米粒的互补特性。值得注意的是，与脂质纳米粒和脂质体相比，LPNs最近已被证明具有优越的体内细胞传递功效。研究证明，无论在体内还是体外，脂质-聚合物杂化纳米粒都能有效的递送siRNA［39］。Jansen等［40］设计了一种脂质-聚合物杂化纳米粒，由脂质和聚乳酸-羟基乙酸组成，成功负载了针对肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）的治疗性siRNA。最近的研究表明，脂质-聚合物纳米粒也能有效地递送mRNA。Su等［41］用磷脂双分子层包裹聚β氨基脂（PBAE），然后通过静电作用将mRNA加载到该纳米颗粒表面，通过鼻腔黏膜给药方式传递mRNA疫苗。因为PBAE固有的pH响应性能够促进内溶酶体的破坏，所以被选为聚合物核心。脂质的作用是赋予PBAE核心的生物相容性，并介导mRNA的吸附。体外实验结果表明，LPN/mRNA复合物很容易被树突状细胞所摄取，并能够将mRNA传递到树突状细胞的细胞质中，以使毒性最小化。另外Ball等［42］考察了mRNA和siRNA的共传递，他们将mRNA和siRNA共同融合在1个由可电离脂类、胆固醇和聚乙二醇等修饰的脂质组成的聚合物中，结果显示，同1个LPN中的siRNA和mRNA无论在体内还是体外都增强了药物的疗效。

本文主要介绍了脂质类材料在递送mRNA疫苗方面的应用。首先，从mRNA疫苗在人体内递送所面临的难点入手，系统性阐述了mRNA疫苗在进入人体后如何透过细胞膜进入细胞质，最终发挥作用的过程；其次，分别介绍了脂质体、脂质纳米粒和脂质-聚合物杂化纳米粒在递送mRNA疫苗方面的研究进展；最后，结合2020年突发新型冠状病毒肺炎，对针对该病毒进行的以脂质材料为载体的mRNA疫苗的研究进展做了简单总结。

mRNA疫苗较传统疫苗安全性高，并且具有合成任意一种蛋白的可能性，所以mRNA疫苗针对现在新型的病毒性传染病以及癌症都可能具有良好的治疗效果。但是mRNA自身稳定性较差，在体内递送时会被人体内酶所降解，导致其研究进展缓慢。随着载体技术的研究不断成熟，新型载体被用来递送mRNA以提高疫苗稳定性。脂质类材料作为一种优良的mRNA疫苗载体，能够与mRNA通过静电作用结合，并且能够保护mRNA在体内不被降解，并且最终将mRNA递送到细胞质中使之发挥作用。但是迄今为止依然没有一种完全成熟的mRNA疫苗被大众所接受。虽然大部分临床前研究证实mRNA疫苗确实能够引起免疫应答，但是mRNA疫苗的安全性一直是研究人员所关注的重点。一方面体外引入的mRNA疫苗有可能引起Ⅰ型干扰素反应，从而引起炎症，甚至会影响自身的免疫系统［49］；另一方面，对于mRNA疫苗载体潜在的毒性，也会导致疫苗安全性问题［50］。所以，在mRNA疫苗开展大规模的临床研究之前，一定要进行严格的安全性评价。目前mRNA疫苗主要面临的问题是：（1）如何合理构建mRNA，使其在体内能够稳定发挥疗效，并且不会影响正常的生理环境；（2）如何构建安全无毒的疫苗递送载体，以提高疫苗的安全性。

总之，脂质类材料作为体内可降解、生物相容性好的仿生材料，在递送药物方面有着巨大潜力，有望成为mRNA疫苗的优选递送载体。展望未来，期待尽早开发出不同冠状病毒的通用疫苗，以便应对可能会出现的其他病毒引起的公共卫生事件，也期望新型脂质载体的研发可以提高疫苗的安全性及疗效，从而更好地保障人类健康。

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