送你个对象
大神一句话，菜鸟跑半年。我不是大神，但我可以缩短你走弯路的半年~
就像歌儿唱的那样，如果你不知道该往哪儿走，就留在这学点生信好不好~
这里有豆豆和花花的学习历程，从新手到进阶，生信路上有你有我！
豆豆写于19.10.26-27
复杂的分析往往需要大量的数据，在R语言中，理解这些东西就需要~对象！
分析单细胞数据，常见的一个对象就是SingleCellExperiment或者sce，那么这次就来认识一下这个基础知识点
这是单细胞分析中的非常常用的S4对象，里面包罗万象，但依然有据可循。那么它是如何组织的？存储了什么内容？这就是我们这次要探索的任务。内容来自：https://osca.bioconductor.org/data-infrastructure.html
首先要上一张图
这个对象一定要不断反复查看
图中最核心的部分，是蓝色的data部分；另外还有绿色的基因注释信息feature metadata、橙色的细胞注释信息cell metadata。除了这三大件，还会包含一些下游分析结果，比如PCA、tSNE降维结果就会保存在紫色的Dimension Reductions
开始发挥想象力了哈！
如果把这个sce对象比作一艘货船，上面就会装载许多集装箱slots（理解为对象接口） 。每个箱子slot都是独立的，箱子里面包含的东西不一样，比如有的装食物，有的装砖头，各有各的特征。就sce来说，有的接口必须是数值型矩阵结构，有的就需要数据框结构。
核心部分-assays
创建一个sce对象很容易，只需要一个assays就可以，这是一个列表，其中包含了许多表达数据，例如原始数据count或者其他标准化处理过的数据，行是基因，列是样本
可以构建一个10个基因，3个细胞的矩阵【一定要是矩阵】
counts_matrix <- data.frame(cell_1 = rpois(10, 10),
cell_2 = rpois(10, 10),
cell_3 = rpois(10, 30))
rownames(counts_matrix) <- paste0("gene_", 1:10)
counts_matrix <- as.matrix(counts_matrix)
有了这个，就可以用一个list构建出SingleCellExperiment对象。当然，这个list中可以包括任意个矩阵
sce <- SingleCellExperiment(assays = list(counts = counts_matrix))
>sce
## class: SingleCellExperiment
## dim: 10 3
## metadata(0):
## assays(1): counts
## rownames(10): gene_1 gene_2 ... gene_9 gene_10
## rowData names(0):
## colnames(3): cell_1 cell_2 cell_3
## colData names(0):
## reducedDimNames(0):
## spikeNames(0):
## altExpNames(0):
为了得到这个对象中的矩阵，可以用两种方式获得：
assay(sce, "counts")：这个方法是最通用的办法，而且其中的counts可以换成其他的名称，只要是出现在之前的list中都可以counts(sce)：它实现的东西和上面一样，只不过这个方法只适合提取counts这个名称的矩阵
counts(sce)
# 或者assay(sce, "counts")
## cell_1 cell_2 cell_3
## gene_1 7 9 35
## gene_2 7 6 38
## gene_3 10 14 32
## gene_4 7 9 32
## gene_5 19 19 48
## gene_6 8 7 26
## gene_7 10 10 28
## gene_8 4 10 26
## gene_9 10 9 37
## gene_10 6 16 26
assays还能扩展
既然有了核心，那么就可以根据它进行多向拓展，这也是它强大的一个原因。
使用标准函数扩展
之前assays中只有原始表达矩阵，其实还能根据它扩展到归一化矩阵，例如使用一些R包的函数对包装的矩阵进行操作：
sce <- scran::computeSumFactors(sce)
sce <- scater::normalize(sce)
> sce
## class: SingleCellExperiment
## dim: 10 3
## metadata(1): log.exprs.offset
## assays(2): counts logcounts
## rownames(10): gene_1 gene_2 ... gene_9 gene_10
## rowData names(0):
## colnames(3): cell_1 cell_2 cell_3
## colData names(0):
## reducedDimNames(0):
## spikeNames(0):
## altExpNames(0):
这样，assays 就从一个存储原始矩阵的counts ，又扩增了归一化矩阵的logcounts 。同理，这个logcounts也是能有两种提取方法：
logcounts(sce)
# assay(sce, "logcounts")
## cell_1 cell_2 cell_3
## gene_1 3.90 3.95 4.30
## gene_2 3.90 3.41 4.41
## gene_3 4.38 4.55 4.18
## gene_4 3.90 3.95 4.18
## gene_5 5.28 4.98 4.73
## gene_6 4.08 3.61 3.89
## gene_7 4.38 4.09 3.99
## gene_8 3.16 4.09 3.89
## gene_9 4.38 3.95 4.37
## gene_10 3.69 4.74 3.89
通过对比这个logcounts和counts数据，就能发现为什么要做normalization这一步：原始矩阵中1、2表达量差不多，但和3差别很大，很有可能是细胞3本身测序深度就比较高，因此得到的reads数也多；进行归一化以后，应该就去除了样本文库差异，结果看到1、2、3之间也变得可比了
到目前为止，我们总共得到了：
assays(sce)
## List of length 2
## names(2): counts logcounts
自定义扩展assays
这里的自定义指的是，我们不使用某个R包的某个函数，而是根据自己的想法，去根据原始矩阵得到一个新的矩阵
# 例如自己创建一个新的counts_100矩阵，然后依旧是通过这个名称进行访问
counts_100 <- assay(sce, "counts") + 100
assay(sce, "counts_100") <- counts_100
看一下结果【注意：新增用的是assay单数，查看结果用的是assays复数】
assays(sce)
## List of length 3
## names(3): counts logcounts counts_100
小结
再回到第一张图，看看assays那里，是不是画了深蓝和浅蓝？这也是为了更好地表达：assays可以包含多个矩阵；构建sce对象可以一次一次加入新的矩阵，也可以用列表的形式，一次加入多个矩阵
列的注释信息：colData
之前有了”核心“——表达矩阵信息，那么其次重要的就是添加注释信息，这部分来介绍列的注释，针对的就是实验样本、细胞。这部分信息将会保存在colData中，它的主体是样本，于是将行名设定为样本，列名设为注释信息（如：批次、作者等等），对应上面图中的橙色部分。
接下来先设置一个细胞批次注释信息：
cell_metadata <- data.frame(batch = c(1, 1, 2))
rownames(cell_metadata) <- paste0("cell_", 1:3)
有了注释信息，怎么把它加入sce对象呢？
两种方法：一种是直接构建，一种是后续添加
直接构建：
sce <- SingleCellExperiment(assays = list(counts = counts_matrix),
colData = cell_metadata)后续添加
colData(sce) <- DataFrame(cell_metadata)
然后看看sce对象添加了什么：
可以看到colData增加了之前设置的batch信息
sce
## class: SingleCellExperiment
## dim: 10 3
## metadata(0):
## assays(1): counts
## rownames(10): gene_1 gene_2 ... gene_9 gene_10
## rowData names(0):
## colnames(3): cell_1 cell_2 cell_3
## colData names(1): batch
## reducedDimNames(0):
## spikeNames(0):
## altExpNames(0):
加入了sce对象以后，怎么获取它呢？
colData(sce)
## DataFrame with 3 rows and 1 column
## batch
## <numeric>
## cell_1 1
## cell_2 1
## cell_3 2
这个注释信息只能自己手动添加吗？
答案是no！有一些包可以自己计算，并且帮你添加进去。例如scater包的calculateQCMetrics()就会帮你计算几十项细胞的质量信息，结果依然是使用colData调用注释结果信息
sce <- scater::calculateQCMetrics(sce)
colData(sce)[, 1:5]
## DataFrame with 3 rows and 5 columns
## batch is_cell_control total_features_by_counts
## <numeric> <logical> <integer>
## cell_1 1 FALSE 10
## cell_2 1 FALSE 10
## cell_3 2 FALSE 10
## log10_total_features_by_counts total_counts
## <numeric> <integer>
## cell_1 1.04139268515822 88
## cell_2 1.04139268515822 109
## cell_3 1.04139268515822 328
既然colData可以包含这么多的注释信息，那么怎么从中选取一部分呢？
例如想从colData中选择批次信息，和数据框取子集是类似的
sce$batch
# 或者colData(sce)$batch
## [1] 1 1 2
然后如果再想取批次中属于第一个批次的信息，就可以继续按照数据框的思路取子集：
sce[, sce$batch == 1]
## class: SingleCellExperiment
## dim: 10 2
## metadata(0):
## assays(1): counts
## rownames(10): gene_1 gene_2 ... gene_9 gene_10
## rowData names(7): is_feature_control mean_counts ... total_counts
## log10_total_counts
## colnames(2): cell_1 cell_2
## colData names(10): batch is_cell_control ...
## pct_counts_in_top_200_features pct_counts_in_top_500_features
## reducedDimNames(0):
## spikeNames(0):
## altExpNames(0):
这样看的colnames中就只剩两个细胞了
行的注释信息：rowData/rowRanges
既然样本有注释信息，那么同样的，基因也有自己的注释，它就存放在rowData或者rowRanges中，这两个的区别就是：
rowData：是一个数据框的结构，它就存储了核心assays矩阵的基因相关信息它返回的结果就是这样：
rowData(sce)[, 1:3]
## DataFrame with 10 rows and 3 columns
## is_feature_control mean_counts log10_mean_counts
## <logical> <numeric> <numeric>
## gene_1 FALSE 17 1.25527250510331
## gene_2 FALSE 17 1.25527250510331
## gene_3 FALSE 18.6666666666667 1.29373075692248
## gene_4 FALSE 16 1.23044892137827
## gene_5 FALSE 28.6666666666667 1.47226875192525
## gene_6 FALSE 13.6666666666667 1.16633142176653
## gene_7 FALSE 16 1.23044892137827
## gene_8 FALSE 13.3333333333333 1.15634720085992
## gene_9 FALSE 18.6666666666667 1.29373075692248
## gene_10 FALSE 16 1.23044892137827rowRanges：也是基因相关，但是它是GRange对象，存储了基因坐标信息，例如染色体信息、起始终点坐标它返回的结果就是这样：
rowRanges(sce)
## GRangesList object of length 10:
## $gene_1
## GRanges object with 0 ranges and 0 metadata columns:
## seqnames ranges strand
## <Rle> <IRanges> <Rle>
## -------
## seqinfo: no sequences
##
怎么按行取子集？
同样类似于数据框，可以按位置、名称取子集：
sce[c("gene_1", "gene_4"), ]
# 或者 sce[c(1, 4), ]
## class: SingleCellExperiment
## dim: 2 3
## metadata(0):
## assays(1): counts
## rownames(2): gene_1 gene_4
## rowData names(7): is_feature_control mean_counts ... total_counts
## log10_total_counts
## colnames(3): cell_1 cell_2 cell_3
## colData names(10): batch is_cell_control ...
## pct_counts_in_top_200_features pct_counts_in_top_500_features
## reducedDimNames(0):
## spikeNames(0):
## altExpNames(0):
看到rownames结果就剩2个基因
除了以上3大块，还有一些重要的”集装箱“需要介绍，这些前面用
附标识
附1：对样本进行归一化：``sizeFactors``
这里面装了根据样本文库计算的文库大小因子，是一个数值型向量，用于后面的归一化
sce <- scran::computeSumFactors(sce)
sce <- scater::normalize(sce)
sizeFactors(sce)
## [1] 0.503 0.623 1.874
前面提到的：assays (primary data), colData (sample metadata), rowData/rowRanges (feature metadata), and sizeFactors 。其实这其中前三个都来自于SummarizedExperiment这个对象。基于这个对象，还建立了一些新的对象接口，例如下面👇的：
附2：降维结果：reducedDims
存储了原始矩阵的降维结果，可以通过PCA、tSNE、UMAP等得到，它是一个数值型矩阵的list，行名是原来矩阵的列名（就是细胞、样本），它的列就是各种维度信息
它和assays一样，也可以包含许多降维的结果，例如用scater包计算PCA：
sce <- scater::runPCA(sce)
# 这个算法是利用了sce对象的归一化结果logcounts(sce)
reducedDim(sce, "PCA")
## PC1 PC2
## cell_1 -0.639 -0.553
## cell_2 0.982 -0.123
## cell_3 -0.343 0.677
## attr(,"percentVar")
## [1] 65.7 34.3
除了PCA，tSNE的结果也是存储在这里：
sce <- scater::runTSNE(sce, perplexity = 0.1)
reducedDim(sce, "TSNE")
## [,1] [,2]
## cell_1 -5664 -542
## cell_2 3306 -4642
## cell_3 2359 5184
看下全部的结果都包含什么：
reducedDims(sce)
## List of length 2
## names(2): PCA TSNE
调取方法也十分类似assay，数据矩阵存储在assays，而调用是assay；这里的降维结果存储在reducedDims，调用是reducedDim
这个降维信息只能自己手动添加吗？
答案也是no！和前面的counts_100加到assays的思路一样，我们也可以自己计算，而不用现成的函数，最后加到reducedDims这个接口。
例如，进行UMAP降维，虽然可以用scater::runUMAP()，但依然可以自己处理。
比如这里使用uwot包，不过这个包只能计算，不能添加到sce对象，需要手动添加：
u <- uwot::umap(t(logcounts(sce)), n_neighbors = 2)
reducedDim(sce, "UMAP_uwot") <- u
reducedDim(sce, "UMAP_uwot")
# [,1] [,2]
## cell_1 0.453 -0.464
## cell_2 -0.115 0.633
## cell_3 -0.339 -0.169
## attr(,"scaled:center")
## [1] 8.69 -2.22
最后再来看一下：
reducedDims(sce)
## List of length 3
## names(3): PCA TSNE UMAP_uwot
附3：metadata 接口
虽然前面介绍了许多接口，但还是有很多DIY的，不能直接导入它们，不过我们仍然需要这些信息，于是medata接口诞生。它可以存储任意类型的数据，只要给它一个名字。
例如，我们有几个感兴趣的基因（比如是高变化基因），现在想要把它保存在sce中，方便以后使用：
my_genes <- c("gene_1", "gene_5")
metadata(sce) <- list(favorite_genes = my_genes)
metadata(sce)
## $favorite_genes
## [1] "gene_1" "gene_5"s
既然是一个列表，就意味着支持扩展：
your_genes <- c("gene_4", "gene_8")
metadata(sce)$your_genes <- your_genes
metadata(sce)
## $favorite_genes
## [1] "gene_1" "gene_5"
##
## $your_genes
## [1] "gene_4" "gene_8"
附4：spike-in信息
使用isSpike来添加：
isSpike(sce, "ERCC") <- grepl("^ERCC-", rownames(sce))
# 结果就会在sce中添加：
## spikeNames(1): ERCC
spikeNames(sce)
## [1] "ERCC"
table(isSpike(sce, "ERCC"))
# 就能看存在多少Spike-in
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