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精准插入大段DNA,新一代基因编辑工具问世

返朴 2022-12-30

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编辑 | 药明康德内容团队


通过对人类基因组的修改,一劳永逸地治疗遗传疾病,是许多科学家的梦想。而基于CRISPR-Cas9而开发的一系列基因编辑系统的问世,让人们看到将梦想变为现实的希望。目前基于CRISPR-Cas9系统的体内基因编辑疗法已经获得概念验证,随后出现的单碱基编辑系统也已经进入临床开发阶段。然而,这些系统在人类基因组中精准插入大段DNA方面仍然具有不少局限性。近日,加州大学伯克利分校和斯坦福大学的科学家组成的研究团队,发现了一系列全新的大丝氨酸重组酶(large serine recombinases,LSR)这些LSR可以将超过7 kb的大型DNA片段精准地插入人类基因组,为基因组工程化研究,以及创新疗法的开发提供了一整套新工具!



导致遗传病的原因有很多,有的时候只是编码蛋白的基因上的一个“字母”出错了,而其它情况下,可能大段的基因片段出现缺失。基因编辑可以通过精准纠正单碱基突变,或者提供缺失基因的替代拷贝,恢复细胞功能并且治疗疾病。


早期CRISPR-Cas9系统能够在人类基因组中特定位置上精准地切断双链DNA,这会激活细胞的DNA修复系统,如果同时添加正确的DNA模板,细胞可能会利用称为同源重组的机制将模板添加到基因组中。


然而这种基因编辑手段并不可靠,有时候会导致双链DNA断裂(DSB)部位附近的碱基缺失,或者产生随机DNA片段插入。新一代碱基编辑系统能够更精准地改变单个碱基,但是在添加大型DNA片段上仍然有局限性。
我们希望开发一种能够将大型DNA片段添加到人类基因组中的简单工具。它不需要产生DNA双链断裂,也不需要依靠细胞的DNA修复机制。”论文的通讯作者之一,伯克利大学的研究员,新近成立的Arc研究所(Arc Institute)的联合创始人Patrick Hsu博士说,“我们的猜测是大自然已经进化出解决这些挑战的工具,它们就藏在噬菌体和其它移动遗传原件(mobile genetic elements)中。“

Patrick Hsu博士丨图片来源:Arc研究所


Hsu博士曾经师从CRISPR领域先驱张锋博士,在开发最初的CRISPR基因编辑系统中做出了重要贡献。在这项研究中,他的团队和斯坦福大学的科学家们合作,对噬菌体中存在的LSRs进行了研究。LSR是噬菌体携带的一种整合酶,它们通过识别细菌基因组和噬菌体DNA片段上的特定序列,将大段DNA序列整合到细菌的基因组中。它的一个优点是可整合包含上千个碱基对的DNA序列,可以容纳一个完整的人类基因。“我们认为LSR具有将突变基因的功能性拷贝递送到基因组中,恢复细胞功能的潜力。”Hsu博士说。

LSR可以介导大段DNA精准整合到细菌的基因组中丨图片来源:参考资料[3]


不过,此前只有少数几种LSRs被科学家们用于基因组编辑,限制它们应用的主要原因之一是整合效率低,只有不到10%细胞的基因组得到修改。与其进一步改造已有的LSRs,这支联合团队另辟蹊径,决定寻找大自然噬菌体中的其它LSRs。在细菌和噬菌体漫长的进化路程中,噬菌体进化出上千种不同的LSRs,它们可能提供更有效的基因编辑工具。
研究人员设计了一种算法,利用计算机系统的搜索噬菌体和细菌的DNA序列,从中发现新LSR种类的信号。利用这一算法,研究人员发现了超过6000种独特的LSRs,将已知的LSRs数目扩展了超过100倍!
对这些LSRs的进一步研究发现,它们具有不同的特征,有些LSRs只能识别细菌基因组上的特定序列,并且将大型DNA片段整合到包含特定序列的位点中。这些序列在人类基因组中并不存在。不过只要在人类基因组中人工引入这些被称为“着陆区”(landing pad)的特定序列,就能够精准引入大型DNA片段。而且,有些新发现的LSRs具有更好的整合效果,在实验中,新型的LSRs可以将超过7 kb的DNA片段,以40~75%的效率,整合到细胞的基因组中。
图片来源:unsplash
另外一类LSRs识别的序列已经在人类基因组中存在。这让它们可以直接用于在人类基因组中引入转基因,实现基因工程改造。研究人员指出,这些LSRs可以用于CAR-T细胞的生产,与目前使用慢病毒介导的转基因递送相比,LSRs介导的转基因整合可以将转基因整合到确定的基因组位点,避免慢病毒介导转基因递送的随机性。而且由于不同的LSRs识别的“着陆区”序列不同,使用不同的LSRs可以在同一个细胞里引入多个不同的转基因,进一步增强CAR-T细胞疗法的功能。
最终,研究人员确认了超过60种经过实验验证,可以在人类细胞中插入大型DNA片段的LSRs。这些LSRs不需要任何宿主细胞内蛋白的参与,不需要指导RNA的引导,而且它们的平均分子量只有Cas9酶的一半,更容易递送进入细胞。
Arc研究所的团队目前在开发靶向人类基因组的LSRs,它们只会在人类基因组的一处特异性导入具有治疗效果的转基因。科学家的目标是开发一种DNA整合平台,不论需要整合的基因是什么,都能够安全、高效地将它们整合到人类基因组中一个独特的位点。“这将提供一种‘通用型’的基因疗法递送策略,并且更容易规模化生产。”Hsu博士表示。
从CRISPR基因编辑工具的问世,到单碱基编辑系统,先导编辑系统的诞生,以及新一代Cas核酸酶的发现,基因编辑工具箱中的工具不断增加,让更精准、更有效地修改人类基因组成为可能。创新LSRs的发现,为基因编辑的工具箱又增添了一种新工具,期待科学的突破尽早发挥基因编辑的全部潜力,转化为造福患者的治愈性疗法。


参考资料

[1] Borrowing from bacterial viruses: New tools for large-scale genome insertions. Retrieved October 11, 2022, from https://arcinstitute.org/blog/genome_insertions?utm_source=twitter

[2] Durrant et al., (2022). Systematic discovery of recombinases for efficient integration of large DNA sequences into the human genome. Nature Biotechnology, https://doi.org/10.1038/s41587-022-01494-w

[3] Stark (2017). Making serine integrases work for us. Current Opinion in Microbiology, https://doi.org/10.1016/j.mib.2017.04.006


本文经授权转载自微信公众号“药明康德”。


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