The Innovation | 精准鉴别新冠变异毒株：PCR技术能否实现？

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全球新冠疫情依旧严峻，不断出现的突变株造成了多地疫情反复。从早期的Alpha毒株，到如今肆虐近百个国家的Delta毒株，变异毒株的传染性逐渐增强，而新冠疫苗的保护效力呈减弱趋势。基因测序是目前鉴别变异毒株的唯一方法，测序技术尚未全面普及，临床诊断识别变异毒株仍存在较大难度。快速鉴别变异毒株对疫情防控具有重要意义。近日，中国科学院微生物研究所研发一种新型单核苷酸差异核酸检测技术，可有效解决当前对变异毒株快速鉴别的需求，该研究在线发表于The Innovation期刊。

新冠病毒（SARS-CoV-2）具有较高的变异性，其外壳上刺突蛋白的受体结合域（RBD）是介导病毒与宿主细胞表面受体结合的关键部位，也是中和抗体和疫苗作用的关键靶点。针对RBD关键位点变异的有效监测具有重要科学意义。研究证明，病毒刺突蛋白E484位点的突变是帮助变异毒株逃逸当前疫苗免疫的关键位点，世界卫生组织认定的重点关注变异毒株（VOCs）Beta和Gamma均包含该位点，E484位点突变导致康复人群及疫苗接种者体内的抗体中和能力大幅降低，从而造成再次感染或突破感染。因此，对变异毒株，特别是含E484位点突变毒株的早期临床监测是疫情防控的关键点。

全球各地已检测出的多个变异毒株得益于高通量测序技术的应用。由于操作流程复杂，对设备及人员要求较高，因此该技术难以普及到临床一线检测，直接影响了我国乃至全球针对变异毒株的监测和快速识别。PCR是一种高效核酸扩增技术，可在短时间内实现核酸分子的指数级扩增，达到高灵敏检测病毒的目的。为应对疫情防控需求，基于PCR技术的核酸检测方法已全面普及，我国县级以上单位均已建立PCR检测平台，可实现对SARS-CoV-2的快速核酸检测。但由于技术局限性，常规PCR仅能完成是否含有病毒的检测，无法精准区分含有单个核苷酸差异的变异毒株。如果能够利用常规PCR检测平台进行变异毒株的鉴定，将在短时间内快速提升对SARS-CoV-2变异毒株监测能力。

为实现这一目的，研究团队开发了一种新颖的核酸检测技术，实现了对单核苷酸差异的精准鉴别。曾有研究指出，鸟嘌呤可通过电子转移的方式淬灭和其相邻荧光基团的荧光，因此在设计常规TaqMan荧光探针时需避免其与荧光基团相邻。但该研究发现当鸟嘌呤与胞嘧啶配对结合后，其淬灭荧光能力会显著下降。基于这一新发现，研究团队开发了一种新型鸟嘌呤自淬灭探针技术，即当探针与目标核酸序列完全互补时，由于鸟嘌呤的淬灭能力消失，探针上的荧光基团可发射荧光；而当探针与具有点突变的目标序列结合时，由于无法形成鸟嘌呤/胞嘧啶配对，荧光基团则被鸟嘌呤淬灭，探针无法发射荧光。由此，通过有无荧光来区分毒株是否突变。该技术能够精准区分核酸中的单个核苷酸差异，让快速鉴别单碱基突变毒株成为可能（图1）。

图1 自淬灭探针区分单核苷酸差异示意图

研究团队将此探针技术与PCR技术相结合，建立了一种双自淬灭探针荧光PCR技术（DSQP-qPCR）。该技术包含一条通用探针和一条特异探针，可同时实现SARS-CoV-2的核酸检测及变异毒株的鉴别诊断，拓宽了目前SARS-CoV-2核酸检测的能力（图2）。且该技术的灵敏度和特异性与常规TaqMan荧光PCR技术一致，临床评价结果显示出良好的相关性。与基因组测序技术不同，DSQP-qPCR技术利用常规PCR技术平台便可实现对样本中含E484突变SARS-CoV-2变异毒株的精准鉴别，易于推广且操作简便快捷，适合大量样本的快速筛查。

图2 检测及鉴定新冠病毒变异毒株

另外，鸟嘌呤自淬灭探针的合成和标记与传统TaqMan探针相似，不需要特殊工艺和设备，因此不会增加额外的成本。由于与常规荧光PCR操作步骤一致，目前具有PCR核酸检测能力的机构均可开展。还可作为测序技术的一项补充方案，用于尚不具备测序能力的机构开展变异毒株的筛查工作。

总结和展望

目前，我国所有二级及以上医院均已建立基于PCR技术的核酸检测平台，开展该技术无需进行设备更新，便可实现基层医疗机构快速鉴定变异毒株，对于提升我国对SARS-CoV-2变异毒株的监测能力具有重要意义。另外，作为一个通用平台技术，不仅可用于新冠变异毒株的鉴别诊断，也可用于其他单基因变异导致的遗传病检测及肿瘤筛查等领域。

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原文链接：https://www.cell.com/the-innovation/fulltext/S2666-6758(21)00108-9

本文内容来自Cell Press合作期刊The Innovation第三卷第一期以Commentary发表的“Rapid and accurate identification of SARS-CoV-2 variants containing E484 mutation” (投稿: 2021-06-29；接收: 2021-11-04；在线刊出: 2021-11-09)。

DOI: https://doi.org/10.1016/j.xinn.2021.100183

引用格式：Zhang Y., Wei Y., Yang S., et al. (2021). Rapid and accurate identification of SARS-CoV-2 variants containing E484 mutation. The Innovation. 3(1),100183.

作者简介

杨利敏，中国科学院微生物研究所刘文军团队副研究员。主要聚焦于抗病毒蛋白质药物和重要疫病新型疫苗研究。发表学术论文20余篇。授权发明专利30项，获得生物制品临床实验批件3项，转基因生物安全证书2项，欧盟CE认证3项。

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