基本概念

诱导多能性干细胞（Induced Pluripotent Stem Cells）：将一些基因（最早是Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4这四个）通过一种逆转录病毒载体导入皮肤等普通体细胞中，让其“初始化”，使其具备干细胞功能，这就是“iPSc”。

CRISPR：CRISPR是指规律成簇的间隔短回文重复，细菌通过CRISPR与内切酶Cas组成的防御系统对抗外来侵略者。CRISPR-Cas能根据导R向NA的指引切割入侵者的遗传物质。现在CRISPR系统是强大的基因组编辑工具。

现在：利用CRISPR技术，“激活”细胞里的单一特定基因，让细胞摇身一变，成为干细胞。

今天，Cell子刊《Cell Stem Cell》在线发表了清华大学药学院丁胜教授研究组的一项研究。研究表明，通过使用CRISPR-Cas9系统靶向激活内源Oct4或Sox2基因，可以成功实现体细胞多能性的诱导。该研究不仅提供了一种构建诱导性多能干细胞的方法，也帮助人们更好地理解了表观遗传修饰调控细胞命运的机制。

目前诱导方法主要有2种：第一种是通过转录因子实现细胞关键信号的开闭，实现普通细胞转化为干细胞；而另一种则是利用一些化学分子组合实现普通细胞转化为干细胞。

而在这项研究中，丁胜教授组采用第三种方法，即CRISPR激活系统靶向内源基因Oct4和Sox2，精确重塑这两个基因位点的表观特征，最终成功构建了iPSC，帮助人们更好地理解了定向染色质重塑触发重编程的机制。

 利用CRISPR-Cas9系统构建iPSC (来源：Liu et al., 2017, Cell Stem Cell)

在这项研究中，丁胜教授课题组使用了dCas9-Sun-Tag-VP64系统。该系统中的多个VP64转录因子可接近靶基因位点，通过募集多种表观遗传修饰因子，增强染色质重塑活性，启动并增强基因转录。

丁胜教授课题组使用的激活基因表达的dCas9-SunTag-VP64系统(下图) （来源：Cell，2014）

为了监测细胞多能性的诱导过程，他们使用了表达Oct4-EGFP报告分子的细胞——多能性标志基因Oct4被活跃转录的同时，细胞中会检测到强烈的EGFP绿色信号。

在这项研究的开始，他们将含有数个sgRNA（共18个）的CRISPR靶向库导入细胞，使其作用于数个多能性相关基因的启动子区。他们发现，这些基因的转录表达能够使体细胞重编程，形成可以稳定传代的iPSC（CRISPR iPSC）。

通过靶向内源基因，成功构建能稳定传代的iPS细胞系

为了鉴定出启动重编程的关键基因，他们通过一一删减靶向库中的靶向基因，发现如果不靶向Oct4、Sox2或Glis1基因，具有多能性的细胞群落会大大减少，表明这些基因对多能性的诱导至关重要。同时，他们注意到细胞重编程的效率明显依赖于Sox2基因的表达水平，事实上，单独针对Sox2启动子的改造即能诱导细胞产生多能性。

但是，以上方法获得的iPSC的比例并不高，他们猜测这或许与所使用的小鼠体细胞的遗传背景和转导效率有关。基于这一点，丁胜教授组用之前获得的CRISPR iPSC，构建了二代小鼠胚胎成纤维细胞S-17。他们发现使用S-17细胞进行诱导，可以大大提高重编程效率。

其中，dCas9-Sun-Tag-VP64系统可通过改变Sox2和Oct4基因启动子区的组蛋白乙酰化水平，来启动二者的表达。他们还证明，靶向Sox2单基因座能启动其转录表达，继而诱导其他多能基因表达，建立多能性网络。

在这个研究过程中，丁胜教授研究组注意到Oct4启动子和增强子的表观重塑对于多能性诱导非常重要。但是仅靶向Oct4的启动子不足以产生EGFP阳性细胞集落。在高表达Oct4的小鼠胚胎干细胞中，Oct4基因的远端增强子处富集着p300、介体复合物和关键多能性因子。因此，他们推测细胞多能性的诱导可能需要同时重塑Oct4的启动子和增强子。

为了验证这一点，他们使用了转录靶向两个不同位点的双sgRNA，在单细胞水平上同时靶向Oct4启动子和增强子区，提高了组蛋白乙酰化水平，并最终实现了重编程的诱导。在获得了具有多能性的细胞之后，他们将其注射入小鼠囊胚，成功实现了种系传代。

这些数据表明，通过同时重塑内源性Oct4的启动子和增强子区的表观特征，能够有效地诱导出细胞多能性。

然而，在这个靶向系统中，VP64的染色质重塑功能主要是因为它能够招募转录因子和表观修饰因子，而非直接改变表观修饰。那么，直接重塑表观特征是否足以启动重编程呢？

为了明确这一点，丁胜教授组采用了另一个靶向系统——dCas9-SunTag-p300core，该系统能够特异性地增加Oct4启动子和增强子区的组蛋白乙酰化水平。

p300是一类乙酰基转移酶，通过与CRISPR-Cas9系统联合，成为了一个非常强大的操纵基因表达的工具。p300 core是p300的活性结构域，它取代了之前系统中VP64的位置，可以增强靶标的组蛋白乙酰化水平。

dCas9与p300的核心催化结构域融合，可以使靶位点乙酰化，发生表观构象重塑。该作用与转录因子、RNA聚合酶II协同上调靶基因转录。（来源：abmgood.com，改编自Zentner等人2015年的图）。

丁胜教授组发现，p300 core的组蛋白乙酰化靶向功能类似于VP64的染色质重塑功能，都能够重塑Oct4启动子和增强子的表观特征，并足以触发重编程，使细胞获得多能性。这项结果有力地证明了单独改变基因的表观特征即能实现重编程。同时也证明了组蛋白乙酰化在iPSC诱导过程中的关键作用。

这项研究中使用的重编程技术也应该适用于其他的细胞类型以及模型。在人类细胞中的应用情况有待进一步研究确认。

研究的主要作者丁胜博士说道：“在研究最初始的时候，看看能否仅激活基因组的一个位点，就对细胞进行重编程。现在我们知道，这是可行的。”

丁胜教授也认为，能有多种诱导多能干细胞的方法，对于科学研究非常重要。如果科学家们在一种方法上碰壁，至少还有其他几种方法可以尝试。“我们的技术能带来更简单的多能干细胞诱导技术，也有望用来直接将皮肤细胞诱导成心脏细胞或脑细胞，”丁胜教授说道：“事实上，仅需调控一个位点，就能诱导干细胞的发现让我们非常惊讶。我们希望了解背后的完整生物学机制。”

参考文献：

1 Buhe Nashun, et al., Reprogramming of cell fate: epigenetic memory and the erasure of memories past. The EMBO Journal 2015 34, 1296-1308

2 Nasir Malik, et al., A Review of the Methods for Human iPSC Derivation. Methods Mol Biol. 2013 997: 23–33

3 Barbara Jusiak, et al., Engineering Synthetic Gene Circuits in Living Cells with CRISPR Technology, Trends in Biotechmology, 2016 34, 7:535–547

4 Tanenbaum ME, et al., A protein-tagging system for signal amplification in gene expression and fluorescence imaging. Cell. 2014 23;159(3):635-46

5 Liu et al., CRISPR-Based Chromatin Remodeling of the Endogenous Oct4 or Sox2 Locus Enables Reprogramming to Pluripotency, Cell Stem Cell 2017, https://doi.org/10.1016/j.stem.2017.12.001

6 Dominguez AA, Lim WA, Qi LS. Beyond editing: repurposing CRISPR-Cas9 for precision genome regulation and interrogation. Nat Rev Mol Cell Biol. 2016 17(1):5-15.