Cell | 空间转录组学联合原位测序揭示阿尔茨海默症的基因共表达模块

研究人员利用原位测序和空间转录组学技术在阿尔茨海默病（AD）小鼠模型中探索淀粉样斑块周围100毫米直径的组织中发生的转录改变，证明了富含髓鞘和少突胶质细胞基因 (OLIG) 的基因共表达网络在疾病早期发生改变；而涉及补体系统、氧化应激、溶酶体和炎症的斑块诱导基因 (PIG) 的多细胞基因共表达网络，则在疾病的晚期表现突出。该项研究由比利时脑和疾病VIB研究中心，以及比利时鲁汶脑研究所共同完成，并于2020年发表在Cell期刊。以下是详细解读。

文章题目：Spatial Transcriptomics and In Situ Sequencing to Study Alzheimer’s Disease

发表时间：2020-08-20

发表期刊：Cell

主要研究团队：比利时脑和疾病VIB研究中心，比利时鲁汶脑研究所等

影响因子：41.584

DOI：10.1016/j.cell.2020.06.038

研究背景

AD研究的一个核心问题是淀粉样蛋白斑块与神经退行性过程的关系。淀粉样斑块可能是AD的触发因素或驱动因素。遗传分析表明，散发性AD的风险与小胶质细胞中对淀粉样蛋白沉积表达有关的基因相关，但星形胶质细胞、神经元和少突胶质细胞也显示出对淀粉样斑块的改变的分子反应。然而，人们对淀粉样斑块附近细胞中发生的分子变化知之甚少。

研究策略

转录组分析：从3、6、12和18月龄的App^NL-G-F和C57BL/6小鼠大脑冷冻切片获得了三个相邻的冠状切片。组织结构域(TD)的直径为100μm，截面厚度为10μm。两个外部切片进行免疫染色，中间的切片进行ST处理。每个冠状切片都包含500多个单个TD的转录组学特征，每个TD都标注了空间、病理和细胞信息。然后，将这三个切片对齐，用Aβ负载(6E10染色)、反应性星形胶质细胞(GFAP)、神经元的存在(Neun)和细胞核(DAPI)对每个TD进行注释。

功能验证：用3名AD患者和3名非痴呆的死后人脑样本进行验证，AD小鼠模型为App^NL-G-F小鼠。

研究成果

1. 基因表达改变与Aβ积累的关系

研究者使用TD中每个像素Aβ荧光强度的标准差作为Aβ指数，以区分轻度和剧烈的Aβ积累。在图1C中，计算了每个脑区TD的Aβ指数平均值，显示与Aβ免疫染色的情况一致(图1A)，说明Aβ从背侧向腹侧皮质、丘脑和海马的延展。

为了解基因表达变化，研究者进行了两种差异表达分析。首先比较了App^NL-G-F和C57BL/6小鼠(基因型模型)，其次研究了Aβ积累对基因表达的影响(Aβ模型)。使用6个转录本进行经典的RNAscope实验，验证了Aβ模型(图1D和1E)。通过绘制按基因型划分的LFC（Log Fold Change）(基因型轴)和每个时间点Aβ的积累(Aβ轴)来比较这两个模型。发现抗原处理、趋化、溶酶体降解和炎症有关的基因在18个月时沿Aβ轴和基因型轴上调。发现髓鞘类有明确的方向转变，在3个月时沿着Aβ轴上升，在18个月时下降，但在基因型轴上没有变化。

图1 将基因表达的改变与Aβ负载联系起来

2. PIG模块的鉴定

斑块诱导基因(PIG)模块包含的57个基因最初轻微上调(图2A)，但在6到12个月之间急剧上调并最终稳定为整个大脑的均匀反应(图2B)。研究者发现在18个月时，App^NL-G-F小鼠所有TD中Aβ的积累与PIG的表达之间存在显著的相关性(r=0.39，p≈0)(图2C)，表明随着Aβ在整个大脑的积累，PIGs表达逐渐增加。发现5个PIGs与A1星形胶质细胞标记物重叠，18个PIGs是DAM/ARM小胶质细胞基因(图2D)，36个PIGs是之前未被定义为与疾病相关的神经胶质基因。激活的小胶质细胞和星形胶质细胞包含了10个连接最紧密的中枢基因(图2D)。评估这些PIGs是否可以在人类数据集被识别时，发现在Mathys等鉴定的41个细胞亚群中，PIGs与AD相关的小胶质细胞的特征具有最高的相关性，特别强调了人类小胶质细胞的标记基因Mic1 (图2E和2F)在Aβ暴露或基因型作用下的基因表达变化。对小鼠的分析表明，人类大脑中的Mic1反应是对淀粉样斑块的多细胞协调反应的一部分，而且这种反应会随着时间的推移而演变。

图2 Aβ斑块诱导基因 (PIG) 的鉴定

3. 原位测序为PIG模块提供细胞级分辨率

应用原位测序(ISS)，使用定制的探针与细胞类型标记（图3A-3C)来匹配PIGs的表达，分别为App^NL-G-F小鼠和18月龄的WT小鼠生成两个ISS文库，将基因表达量化为每个基因荧光斑点的数量，并将斑点分配到淀粉样斑块周围的5个同心环中(图3D)。为研究PIG网络的细胞特征，研究者计算细胞类型标记在其5微米半径内的富集程度，将每个斑点分配到一个细胞类型(图3G)。PIG对Aβ的反应主要由小胶质细胞和星形胶质细胞贡献(图3H)。

使用RNAscope原位杂交技术在18月龄的App^NL-G-F小鼠中验证了补体成分(C1qa, C4和Clu)的表达。证实C1qa由Itgams阳性细胞(小胶质细胞)表达，Clu由Slc1a3阳性细胞(星形胶质细胞)表达，C4由Mbp阳性细胞(少突胶质细胞)表达，并且这些细胞都在淀粉样斑块附近。RNAscope检测到的这3种补体成分的细胞特征与ISS的分析一致。

图3 ISS鉴定的PIGs细胞特征

4. PIGs模块中小胶质细胞和星形胶质细胞基因的共表达

为了解不同细胞PIGs之间表达的相关性在多大程度上由积累Aβ的病理学驱动，研究者对PIGs进行了WGCNA分析，根据Aβ指数将所有ST TDs分为WT和AD的四个分位数(图4)。

在WT小鼠中，PIGs的整体连通性较低(图4)。在Q4(淀粉样蛋白载量最低)中，共表达总体上较弱。Q3中，蓝色和橙色簇中的几对基因共表达变强，如细胞-细胞粘附/迁移分子Lgals3bp和Cx3cr1，糖苷酶Lyz2和Gusb等。在Q2至Q1中，三个簇之间建立了强大的联系。最强的连接是在Ctsd(绿色)和C1qa、C1qb、Ctsb、Ctss和Hexb(蓝色)之间或Apoe(绿色)和C1qb(蓝色)之间。橙色和其他两个簇之间最强的连接从Trem2和Tyrobp(橙色)到Ctsd、B2m和Apoe(绿色)，再到C1qa、C1qb、Hexb和Ctss(蓝色)。尽管在淀粉样斑块中Apoe(对照组中仅在星形胶质细胞中表达)与小胶质细胞基因连接的增加至少部分可由诱导靠近斑块的小胶质细胞中Apoe的表达来解释，大多数其他PIGs仍然在它们各自的细胞类型中表达，而相互作用的增加表明基因在不同细胞类型中的共表达。

图4 根据Aβ的累积逐步实现PIGs的共表达

5. 少突胶质细胞模块显示不同的区域反应

OLIG模块最富集的功能类别是神经元鞘、髓鞘、轴突鞘和髓鞘化。将OLIG与已发表的小鼠单细胞数据库进行比较，证实其与少突胶质细胞有很强的相关性。且OLIG与人类AD相关的少突细胞Oli0有很强的相关性。研究突出了20个人类Oli0标记基因的小鼠同源基因(图5A和5B)。一些Oli0的直系基因与OLIG模块一起上调或下调。

接下来研究者更详细地分析了Aβ指数和OLIG表达之间的关系，并将其作为这些脑区差异的函数。3个月时，随着分布在Q4-Q2的TDs中Aβ的轻度积累，OLIG表达增加(图5D)，在Aβ暴露最高的TDs中，OLIG的表达呈下降趋势 (Q1的Aβ是Q4的21倍)。此外，低Aβ暴露的TDs中，OLIG模块的基因对连接强度之和最强。为进一步证实这些发现，研究者在3月龄App^NL-G-F小鼠的全冠状脑组织上，分别使用针对4种OLIGs (Plp1、Mbp、Olig2和Cnp)的探针进行了一系列有限的RNAscope实验(图5E、5F)。结果表明，即使在3个月时，致密淀粉样斑块周围的4个OLIGs也明显减少。因此，部分OLIG模块的区域变化与不同的Aβ暴露有关。

图5 OLIG模块对Aβ积累的时空响应

6. 人类大脑中PIG和OLIG模块的可视化

研究者从3名AD和3名非痴呆受试者身上提取了死后的人脑样本，对与AD相关的额上回（BA10）组织进行了分析，共222个基因表达谱。细胞标记基因概述了该脑区的细胞分布（图6A）。与预期一致，PIG模块(图6B，紫色)和OLIG模块(图6C，红色)基因分别在灰质和白质中富集。

紧接着研究了对照组和AD大脑中PIGs的人类直系同源基因的分布，发现大多数PIGs在AD和对照组中在相同的细胞类型中表达(图6D)。研究者最终确认在45个可检测的PIGs中，只有18个在淀粉样斑块细胞位置显著富集，包括9个小胶质PIGs，5个星形胶质PIGs, 以及在多种细胞类型中表达的5个PIGs。研究者分析了OLIG模块中差异表达程度最大的42个人类直系同源基因的细胞特征(图6E)。发现APOD（一种脂蛋白编码基因，通常由少突胶质细胞表达）在AD患者中上调，在AD患者的小胶质细胞中也显著富集。因此，人类自淀粉样病变开始就会产生许多变化，且在小鼠PIG和OLIG模块中发现的许多基因在AD晚期也显示出显著变化。

图6 ISS在人脑中可视化的PIG和OLIG模块

总结

本研究展示了ST和ISS技术以脑疾病为导向的应用。数据表明，淀粉样斑块与疾病有关。事实上，在淀粉样斑块细胞生态位中，所有细胞类型都会产生强烈的协调反应。需要进一步的工作来了解淀粉样斑块的去除（例如通过免疫），是否以及何时足以逆转这些正在进行的细胞过程。较为明显的是，与淀粉样斑块结合的抗体会调节这些神经胶质反应，这将使临床试验结果的解释复杂化，因为这些细胞效应可能因不同的抗体而异。

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