Nature | DNBelab C4如何助力获得人类体外诱导全能干细胞？研究思路详解
近日，深圳华大生命科学研究院联合中国科学院广州生物医药与健康研究院、吉林大学、英国剑桥大学以及孟加拉国的多个研究团队在《自然》（Nature）上在线发表了题为“Rolling back of human pluripotent stem cells to an 8-cell embryo-like stage”的文章。研究人员开发了一种非转基因、快速且可控的重编程方法，可将人多能干细胞（PSC）诱导为全能性的8细胞期胚胎样细胞（8CLC）。基于华大自主开发的单细胞建库测序平台（DNBelab C4），研究人员应用单细胞测序技术分析确定了8CLC与人8细胞期胚胎的高度相似性，解析了转化过程的关键分子事件和基因调控网络，并进一步证明产生的8CLC全能性细胞具有在体外或体内以类囊胚和畸胎瘤等形式产生胚胎和胚外谱系的能力。我们邀请了文章作者之一、中国科学院大学博士研究生李金秀对文章进行了详细解读。
文章题目：Rolling back of human pluripotent stem cells to an 8-cell embryo-like stage
发表时间：2022-03-22
发表期刊：Nature
主要研究团队：中国科学院广州生物医药与健康研究院Miguel团队、深圳华大生命科学研究院刘龙奇团队
DOI：https://doi.org/10.1038/s41586-022-04625-0
研究背景
人类受精卵形成初期，自身基因不表达，而需要依赖卵子携带的母源因子执行细胞功能。随着受精卵的不断分裂，当到达8细胞期时，卵子来源的母源因子逐渐降解消除，而胚胎自身的基因被激活，个体开始依赖自身的基因表达完成后续发育。8细胞期发生的该过程被称作合子基因组激活，是胚胎发育的关键节点，该过程的异常可直接导致胚胎发育的停止。因此，研究8细胞期细胞调控机制对于保证良好的早期胚胎发育有重要意义。
研究方法
研究团队通过系统性的筛选，首次建立了体外全能性8CLC的诱导和富集方法。基于华大自主研发的可方便携带、易上手操作、低建库测序成本的DNBelab C4平台，我们对8CLC诱导过程的细胞样本进行了单细胞转录组（scRNA-seq）和染色质可及性（scATAC-seq）测序，详细分析了8CLC群体的特征，并在多个诱导时间点描绘了8CLC诱导过程中转录组和染色质开放性的动态变化(https://db.cngb.org/search/project/CNP0001454/)，为研究人类8细胞期的合子基因组激活和发育调控提供了重要的平台和资源，将拓展我们对人类早期胚胎发育的有限认知。
研究成果
1. 建立人类8细胞样细胞（8CLC）体外诱导的平台
我们在前期通过筛选，建立了新型的人类8CLC体外诱导培养基e4CL和两种不同的8CLC诱导方法：直接诱导法和阶段诱导法（图1a）。诱导后获得的全能性细胞（8CLC）比例为10-15 %。我们构建了可用于筛选纯化8CLC的报告基因细胞系，该细胞系能够帮助我们对大量纯化8CLC进行功能和机制研究。为了测试此诱导方法产生的8CLC反应8C胚胎细胞的相似度，我们将阶段诱导法获得的8CLC与体内胚胎数据进行了整合（图1b）。诱导的细胞逐渐从类似胚胎第7天（E7）的状态回到类似胚胎第5天（E5），当诱导结束时，细胞与胚胎第三天（E3，即8细胞期）类似（图1b）。我们还从染色质开放状态、DNA甲基化修饰等多个角度验证了8CLC和8细胞期胚胎的相似性。
图1 人全能性8CLC的诱导方法及与胚胎发育时期的比较
2. 鉴定8CLC转换中的分析调控网络
为了探究8CLC的调控网络，研究团队基于单细胞测序数据，使用加权基因共表达网络分析（scWGCNA）定义了共表达模块和中枢基因。该分析揭示了不同细胞状态的基因调控网络（GRN）。8CLC GRN的核心参与者包括DPPA3、TPRX1、ZSCAN4和DUXA等（图2a）。这些GRN中许多基因的功能在很大程度上是未知的，反映了我们迄今为止对人类早期发育阶段和全能性的有限了解。
此外，团队比较了同一时间点8CLC与其他细胞（非8CLC）中的差异表达基因（DEG）。8CLC高表达基因中包含了预测出的8CLC GRN关键调节因子，包括DPPA3、TPRX1、ZSCAN4、DUXA和ZNF280A。我们对其中表达差异最显著的DPPA3和TPRX1进行了功能实验验证。干扰DPPA3的表达抑制8CLC的诱导（图2b），且该作用是由DNA甲基化水平上调引起的。同时，敲除TPRX1也能显著抑制8CLC的诱导（图2c），说明DPPA3和TPRX1是8CLC状态建立的关键调控因子。
通过这部分内容，我们提供了8CLC转换的分子路线图，并且剖析了其中的调控网络，鉴定出DPPA3和TPRX1为诱导8CLC的两个核心因子，见图2。
图2 8CLC基因调控网络和核心调控因子DPPA3、TPRX1 的功能验证
3. 评估8CLC的分化潜能
利用纯化的8CLC，研究团队从滋养层细胞分化能力、模拟人类囊胚形成能力和畸胎瘤分化过程中产生胚外组织细胞的能力等方面系统评估了8CLC的分化潜能。
分选后的8CLC在3D培养条件下，可以自发形成类似人胚胎囊胚阶段的结构（称为类囊胚）。利用囊胚内细胞团标记蛋白OCT4 和滋养外胚层标记蛋白GATA2进行免疫荧光，验证了8CLC产生的类囊胚在标记蛋白上与囊胚的相似性（图3a）。此外，我们对该类囊胚结构进行了单细胞转录组测序，分析结果显示全能性8CLC产生的类囊胚具有上胚层、下胚层和滋养外胚层，与胚胎构成类似（图3b,c）。
畸胎瘤常被用来评估多能干细胞在体内的发育潜能，也是研究谱系发育的良好模型。为了检测8CLC的发育潜能，我们利用不同多能性状态的细胞和分选出的8CLC产生畸胎瘤，并进行了基于DNBelab C4平台的高通量单细胞转录组测序。实验共得到了227,598 个单细胞，注释出24种细胞类型。结果显示，分选的8CLC来源的畸胎瘤包含胚胎外滋养细胞谱系和更丰富的其他谱系如生血内皮细胞和免疫细胞等（图3d）。
总的来说，8CLC具有胚胎的三胚层和胚外的滋养层发育潜能，即具有全能性，在功能层面上与人类8细胞期细胞的分化能力契合，是研究人类早期胚胎发育的可靠材料。本文涉及的所有实验均符合国际伦理规范的要求，并经过了严格的伦理审查。
图3 利用类囊胚模型和畸胎瘤实验验证8CLC全能性发育潜能
结论&展望
该研究项目填补了体外人8细胞期胚胎样细胞的空白，与人多能性状态的细胞相比，全能性的8CLC具有更好的发育和分化能力等众多优势。该成果对早期胚胎发育相关的基础研究提供了新的体外研究体系，有助于我们理解早期胚胎发育过程及其调控网络与疾病发生的关系，为防治出生缺陷及多种发育源性疾病提供理论基础和可行路径；同时也为全能性细胞用于细胞治疗和疾病建模提供了更好的模型选择。科研团队将会进一步建立高效率、高纯度的人8CLC全能性细胞生产平台，并利用全能性细胞制备功能性细胞和药物筛选平台。
Md. Abdul Mazid、Carl Ward、骆志伟和刘传宇为该论文的共同第一作者。
Miguel A. Esteban、李文娟、刘龙奇和Md. Abdul Mazid为论文的共同通讯作者。
为解决单细胞规模化研究痛点，华大开发了高通量单细胞平台DNBelab C4，联合DNBSEQ超高通量测序平台，实现单次测序数据产出规模达百万级细胞，在大幅降低建库成本的同时实现全局性的组织细胞图谱，是当前可以实现高通量、低成本、一站式单细胞组学研究的全流程技术平台，在器官结构、发育、人类疾病、生命演化等领域全面发挥重要作用。DNBelab C4平台以独特的竞争力推动组学研究不断发展，未来也将助力更多高质量研究开展及文章发表。
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