Cell Stem Cell | 人类下丘脑发育的时空转录组动态特征
北京师范大学吴倩课题组、中科院生物物理研究所王晓群课题组联合首都医科大学附属安贞医院张军课题组，利用单细胞转录组技术和免疫荧光定位系统深入地揭示了胚胎发育的早期和中期人类下丘脑的细胞类型特点和时空动态变化、不同细胞谱系发育轨迹的时空特征，为深入了解其空间和功能复杂性奠定重要基础。该文章在2022年2月发表于Cell Stem Cell，以下是详细解读。
文章题目：Deciphering the spatial-temporal transcriptional landscape of human hypothalamus development
发表时间：2022-02-03
发表期刊：Cell Stem Cell
主要研究团队：北京师范大学, 中科院生物物理研究所, 首都医科大学附属安贞医院
影响因子：24.633
DOI：10.1016/j.stem.2021.11.009
研究背景
下丘脑由形态及功能各异的多种神经细胞亚型聚集而成，具有高度异质性，对机体的生理活动、稳态调节具有重要作用。成体下丘脑的神经元种类呈现出多样性及功能特异性，即使在特定的核团内，不同的神经元类型表现出独有的基因表达模式和空间分布特征，这与其功能密切相关。之前的研究发现了在哺乳动物下丘脑存在类似于皮层oRG细胞(outer radial glia)的hmRG细胞(hypothalamic mantle zoneradial glial)，这群细胞是一种新发现的神经干细胞，在下丘脑发育中有着重要的作用，但是对于人下丘脑核团类结构的空间架构及细胞多样性产生的分子机制仍不是很清楚。
研究方法
在显微镜下，用振动刀从冠状面600mm厚的连续切片中手工解剖不同孕周的整个下丘脑。取样时间点包括GW7 (第7孕周)、GW8、GW10、GW12、GW15、GW18、GW20，其中GW12和GW18处有2个生物学重复。GW15、GW18_1、GW20切片（包含整个下丘脑）大致分为前、后、轴3组，大致对应于前部、管状/内侧和后部区域，以便研究前、后、轴是否存在空间发育差异。取完样本后研磨样品并过滤形成单细胞悬浮液，进行单细胞测序，描绘下丘脑发育的细胞和基因表达的时空特征。
图1 研究设计和主要发现
研究成果
1. 发育中的人类下丘脑转录图谱多样性
通过对不同孕周的下丘脑样本进行单细胞聚类分析，所有的细胞分成了42个簇，分别注释成神经元上皮细胞、神经元前体细胞等11个细胞类型。根据时间发育进程，对所有的样本进行了4分类，比较了不同发育阶段的细胞类型比例并对差异基因做了GO富集分析。结果表明，GW7下丘脑细胞主要由祖细胞组成；随着发育的进行，神经细胞群在GW8-10时开始分化为不同的神经元，在GW12-15时出现星形胶质细胞和OPC；G18-20后期，主要决定胶质细胞命运，包括星形胶质细胞，OLs（OPCs和OLs）和小胶质细胞。有趣的是，根据转录组数据和免疫染色验证，观察到在GW15下丘脑后部区域的神经胶质细胞比例低于前部/内侧区域。
图2 发育中的人类下丘脑中细胞类型和转录图谱
2. 早期下丘脑NE和NP细胞的异质性
对GW7的细胞进行NE(neuroepithelial)和NP细胞(neural progenitor)的异质性分析。先进行聚类分析，可以将所有细胞分为NE、NP、神经元和间充质脑膜样成纤维细胞等4大类。神经元细胞重聚类后又分成了GABAergic和glutamatergic神经元2个亚类。同时，本研究又对GW8时期的样本进行了免疫荧光染色, 表明不同类型细胞的基因表达和位置（图3B、图3C），且表达VIM的 NE细胞在第三脑室的顶端表面富集（图3C）。把成纤维样细胞去掉后，对GW7时期的样本进行拟时序分析，发现了从NE到NP的细胞发育谱系。通过对NE和NP的差异基因表达分析，发现从NE到早期祖细胞的谱系转变的关键信号，如Hippo、WNT、Notch等。
接下来对NE和NP进行亚类分析，NE分成了7个亚类，NP分成了8个亚类。同时还进行了早期NE和NP之间的潜在关系分析，结果表明，NE3作为假定的前/结节NE（presumptive anterior/tuberal NE），将主要分化为NP3和NP4，可能向结节核形成。弓形核NP5来源于NE4。还发现，不同下丘脑位置的、具有独特潜在细胞命运的早期NPs显示出分子异质性，并且NE细胞早在GW7时就可能确定了细胞命运。
图3 早期下丘脑NE和NP细胞的异质性
3. 由调节基因（调节子）控制的不同神经元祖细胞命运
NP可被分成25种细胞类型。为了深入了解祖细胞亚群的基因调控网络，研究人员使用SCENIC算法进行了“调节子”分析，发现主要的分支点是神经发生或胶质细胞生成。胶质细胞谱系富含涉及胶质细胞的多种已知调节，包括OLIG1/2、SOX8等。在OL谱系(Oligodendrocyte lineage)中检测到OLIG1/2和NKX2-2的共表达，而FOXJ1、GLIS3和AXNA1在祖细胞亚群中富集，并分化为星形胶质。还有几个胶质细胞亚群富含以祖细胞维持为特征的多个调节子，这些细胞被定义为包括放射状胶质（RG）细胞。DLX1/2/5/6、SOX3、LHX1、ONECUT2和OTP这些调节子对人下丘脑中的神经元祖细胞具有特异性，而PITX2和EMX2对于管状/后部祖细胞是必不可少的，ECUT2和DLX6对于前部/管状祖细胞亚型是必不可少的。还发现在管状NP亚型中表达的OTP和PRDM12调节子可以调节不同的ARC神经元(Arcuate nucleus neuron)命运，即OTP调节PCP4神经元(Purkinje cell protein 4 neuron)，PRDM12调节POMC神经元(Proopiomelanocortin neuron)。
图4 调节子调节的下丘脑祖细胞的发育多样化
4. 下丘脑神经元的时空组成
为了区分分子层面不同的神经元，研究人员将神经元细胞分成了50个簇。这些细胞大部分位于发育中的间脑内，可分为GABA能神经元（标记基因SLC32A1）、谷氨酸能神经元（SLC17A6）和组胺能神经元（HDC）等；基于多种不同神经肽、关键空间转录因子和受体的联合表达，研究人员进一步注释了这些神经元细胞的亚型构成，反映了人类下丘脑神经元的高度异质性。如预期的一样，大多数亚群是通过多个整合的分子标记而不是单个基因来区分的。
为了表征人类下丘脑核的空间组织，研究人员分析了几个核的胎龄相关分布，包括位于前部区域的PVN/SON和视交叉上核（SCN），位于结节区的外侧下丘脑(LH)、VMH和ARC，以及位于后部区域的TMN、结节乳头末端（TT）和SMN/内侧乳头核（MMN）（图5C）。结果显示前/管区的核发生在早期（GW7-8），在GW10达到峰值，而后区的核发生在GW10之后。表明人类下丘脑中的不同细胞核在不同的时间窗口中形成，遵循前后和外向内空间排序。
图5 不同转录状态的神经元亚群
5. ARC神经元亚群的不同谱系轨迹以及不同OLs的分子特征
为了进一步研究细胞核的发育，研究人员将重点放在ARC，因为这个细胞核发育较早。研究人员共收集了3,628个ARC神经元；基于DEG分析，分成了6个亚类。并通过整合和预测分析确定了有助于ARC形成的NP，分别是NP1、NP2和NP17。从NP1、NP2和NP17中提取了与ARC相关的祖细胞，与ARC一起进行拟时序分析，结果表明ARC神经元亚群的分子具有多样性，并且它们在不同时间发育。
接下来研究人员将胶质细胞进行了亚分类，然后又将少突胶质细胞分成4个亚型。鉴定了人类下丘脑不同类型的少突胶质细胞亚类和分子表达特点，表明少突胶质细胞谱系分化具有早、晚两个发育轨迹，不同发育阶段的少突胶质细胞具有较高异质性。通过细胞间互作和差异表达基因富集分析，揭示了早期形成的少突胶质细胞与神经元细胞之间可能通过Wnt、Hippo和Integrin等信号通路参与神经元发育的调节。
图6 OL成熟期间的转录动态
6. 人和鼠下丘脑神经胶质细胞的转录模式差异
研究人员将人类下丘脑的主要细胞类型映射到已发表的小鼠RNA-seq数据集。根据人类和小鼠数据集的模式特征与主要细胞类型之间的相关性，发现了大量的人类特异性基因在下丘脑的主要细胞类型特异性地富集，并重点研究了富含神经元的高表达人类特异性基因，强调了这些基因在不同神经元亚型中的表达。
研究人员发现，与小鼠相比，人类下丘脑胶质细胞生成存在早期发生阶段，并显示出与小鼠不同的独特的转录谱表达特征，而这些早期生成的胶质细胞可能参与了早期神经元的发育过程。
图7 人与小鼠下丘脑细胞类型的分子差异
总结
该研究是一项运用单细胞转录组技术进行器官发育尤其是脑发育研究的典型案例。运用单细胞转录组和免疫荧光技术，揭示了人类下丘脑发育的转录组谱和细胞类型构成和时空变化特征，有以下主要发现：1）神经元祖细胞的命运是由多个转录因子决定的；2）不同细胞核的神经元亚型出现时，在时间上具有不同的基因表达；3）人下丘脑神经胶质细胞发育具有空间不同步性；4）下丘脑神经胶质细胞发育在时间和基因上具有物种差异。该研究提供了早期和中期胚胎阶段人类下丘脑发育的转录全景，并为理解其空间和功能复杂性奠定了基础。
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