统一的脊髓细胞类型及其空间组织图谱 | 时空简讯16期
时空简讯第16期。
脊髓，作为一种高度有序的中枢组织，从脑干的延髓延伸到椎骨的腰椎，与脑一起组成中枢神经系统，主要负责躯干和四肢的反射动作，以及传送脑和外周之间的神经信息。从单细胞和空间组学角度研究脊髓，对深度理解其生物学和生理功能、疾病尤为重要。本期简讯从脊髓细胞类型图谱展开，总结了多篇脊髓及相关结构的细胞构成、发育、神经发生、损伤再生等单细胞转录组学和多组学研究，供了解参考。
小鼠脊髓细胞类型及其空间组织的多数据集整合图谱
Nature Communications [IF: 14.919]
① 建立了一个整合并经验证的新生小鼠脊髓细胞类型图谱，对细胞类型分辨和表征的细节深度和总体广度优于先前研究，揭示了脊髓神经元多样性的组织原则（organizing principles），可作为未来工作的标准和基础；
② 出生后小鼠6个脊髓单细胞公共数据集整合分析，聚类鉴定到15种非神经细胞类型和69种神经细胞类型，并根据特征表达谱筛选到7个标记基因（Sox5、Col5a2、Enpp1、Dcx、Nmu、Tac1和Tac2），用于细胞类型鉴定，经原位杂交验证；
③ 揭示了背侧和腹侧神经元细胞之间的显著差异，包括细胞亚群构成、关系和分子趋势，如背侧的细胞系是不同的、彼此清楚分开的单个细胞类型，可以松散地分成组，而腹侧细胞系间更加相似，在主成分空间和重叠基因表达模式上分布紧密或重叠；
④ 胚胎到成年阶段的小鼠脊髓神经元联合分析，推断出生后每种细胞类型的发育谱系关系，揭示了从多个谱系到多种细胞类型的复合收敛贡献（complex convergent contributions），如多种背侧兴奋性细胞类型来自于一组混合的dI5谱系和dI3.3/dI3.4胚胎；背侧dI4.6/dI6谱系的细胞亚群参与大多数腹侧抑制；dI5.5、dI2.1对Excit-20，以及V1、V2b对Inhib-27的双重贡献；
⑤ 测试了3种已有自动细胞分类算法（标签转移、支持向量机和全连接神经网络），确定一个脊髓细胞类型分类的最佳算法：基于标签转移（第一层）和神经网络（第二层）的双层模型；
⑥ 提供了一个可按照基因或细胞类型查询的、在线脊髓细胞类型分析和分类工具——SeqSeek（seqseek.ninds.nih.gov），用于从原始测序数据中获取任何脊髓细胞或细胞核的自动分类算法。（MR. Shao/Lina）
脊髓单细胞数据来源和细胞类型构成
A harmonized atlas of mouse spinal cord cell types and their spatial organization.
2021.09.29, DOI: 10.1038/s41467-021-25125-1.
研究文章；生命发育，生命结构；小鼠，新生，成年，脊髓，scRNA-seq，细胞类型，分子组织；Daniel E. Russ, Ryan B. Patterson Cross，Ariel J. Levine；National Cancer Institute, National Institute of Neurological Disorders and Stroke; USA.
中科院北京基因组研究所王前飞课题组：巨核细胞功能和空间的多样性
Blood [IF: 22.113]
① 突破了巨核细胞（megakaryocytes，MKs）分离技术的瓶颈，通过镜下流式分选、手工挑选、荧光原位杂交和免疫荧光等多种技术组合，开发了一种从多个倍性阶段（2N~32N）小鼠和人类供体脊髓中，有效获取MKs的手工分离方法，成功分离出具有活性的原代单个CD41+ MKs；
② 结合scRNA-seq分析、原位三维免疫荧光成像技术和功能分析，首次绘制了骨髓MKs体内单细胞空间转录组图谱，发现了其丰富的功能和空间多样性，并发现小鼠和人类具有相似的转录异质性；
③ 在小鼠和人骨髓中鉴定到4个CD41+ MKs异质性亚群：1个多倍体化MK亚群（cluster 1）、3个功能MK亚群（造血干细胞生态位相关 cluster 2、炎症反应相关cluster 3和血小板生成cluster 4），原位免疫染色发现，cluster 2和 cluster 4由高倍性细胞组成，而cluster 3由低倍性细胞组成；
④ 利用公共数据库的单细胞或bulk RNA-seq数据，比较了髓系cluster 3和淋巴系细胞的转录组，发现cluster 3具有一种单核细胞样（monocytic-like）的转录机制，使其中的CD53+ MKs不仅可以快速应对炎性刺激发生群体增殖，而且具有吞噬、抗原递呈等功能，可能是一种新的免疫细胞。（于新颖/Lina）
研究设计流程图
Single-cell analysis of ploidy and transcriptome reveals functional and spatial divergency in murine megakaryopoiesis.
2021.10.07, DOI: 10.1182/blood.2021010697.
研究文章；生命结构；小鼠，脊髓，巨核细胞，scRNA-seq，转录组学，细胞异质性，细胞功能；Shu Sun, Chen Jin, Yueying Li, Qian-Fei Wang；中国科学院北京基因组研究所，国家生物信息中心；中国
小鼠脊髓损伤后的免疫异质性及小胶质细胞再生
Cell Death and Disease [IF: 8.469]
① 绘制了小鼠脊髓损伤（spinal cord injury，SCI）早期（3 days-post-injury, 3 dpi）和晚期（14 dpi）免疫细胞的动态单细胞转录图谱，单细胞分离中用放线菌素D抑制细胞状态变化，共获得20,217个CD45+免疫细胞（对照组2,131个，3 dpi 8,363个，14 dpi 9,723个）转录组数据；
② 3 dpi时，出现小胶质细胞减少和周围髓系细胞浸润，在14 dpi时，出现小胶质细胞再生、髓系细胞减少和淋巴细胞浸润；
③ 迁移树突细胞（dendritic cell subsets，migDCs）和淋巴B细胞在正常生理条件下位于脑膜中；炎症反应中，migDCs可以转移到引流淋巴结（draining lymph nodes），与抗原加工和呈递、伤口愈合以及氧化磷酸化有关，而B细胞在3 dpi时减少，14 dpi时恢复至正常水平；
④ nestin+和Cx3cr1+细胞体内遗传谱系追踪发现，脊髓损伤后小胶质细胞的再增殖来源于残余小胶质细胞，且后者在脊髓损伤早期，退化至发育状态从而重新增殖；
⑤ 低氧诱导因子1α（Hif1α）是介导细胞对缺氧微环境适应的关键转录因子，经条件性基因敲除试验证实，Hif1α也是小鼠脊髓损伤后，小胶质细胞再生和功能恢复的关键因子。（Lina）
CD45+细胞分离及scRNA-seq
Single-cell transcriptome analysis reveals the immune heterogeneity and the repopulation of microglia by Hif1α in mice after spinal cord injury.
2022.05.03, DOI: 10.1038/s41419-022-04864-z.
研究文章；疾病病理；小鼠，脊髓，损伤，小胶质细胞，Hif1α，scRNA-seq；Jingyu Wang，Lintao Xu，Weiwei Lin，Linlin Wang, Yingying Chen，Yongjian Zhu；浙江大学医学院附属第二医院，浙江省神经疾病临床研究中心，浙江大学医学院；中国
小鼠脊髓单细胞核转录揭示自主和骨骼运动神经元的分子多样性
Nature Neuroscience [IF: 24.884]
① 使用荧光激活的细胞核分选方法，从雌性、雄性和混合型的野生型成年小鼠的脊髓中提取了43,890个单核转录本（http:/ /spinalcordatlas.org），以富集运动神经元的细胞核；
② 对所有内脏运动神经元进行亚分组，通过限制同时分析的细胞类型的多样性，并沿着内脏运动神经元特有的变异主轴进行亚聚类，解析了16个交感运动神经元簇，发现它们可以通过神经调节信号基因的空间定位和表达来区分；
③ 提出了新的α和γ运动神经元标记物，并鉴定了1个新的骨骼运动神经元群体（γ*）。（刘卓雅）
研究技术路线
Single-cell transcriptomic analysis of the adult mouse spinal cord reveals molecular diversity of autonomic and skeletal motor neurons.
2021.02.15, DOI; 10.1038/s41593-020-00795-0.
研究文章；生命机理；小鼠，脊髓，运动神经元，snRNA-seq; Jacob A. Blum, Sandy Klemm, Jennifer L. Shadrach, Aaron D. Gitler; Stanford University; USA.
RNAscope原位杂交揭示小鼠和人类背根神经节神经元亚群的数量差异
Pain [IF: 6.961]
① 对来自患者和8周龄雄性小鼠的脊髓背根神经节组织（dorsal root ganglion, DRG），通过多重RNAscope原位杂交技术（multiplexed RNAscope in situ hybridization; 16个靶标基因），表征了感觉神经元群体的分布，证实了啮齿动物模型和人类之间的靶点同源性，强调了人类感觉组织作为疼痛疗法研究模型的重要性；
② 多重RNAscope结合已知的痛觉感受器神经元亚群标记物（降钙素基因相关肽CGRP，和P2X嘌呤能离子通道3型受体 P2X3R），量化了Trp-通道、胆碱能受体、钾通道、钠通道、免疫和其他标记物等在小鼠和人类DRG细胞中mRNA表达；
③ 人和小鼠DRG神经元构成和表达谱存在高度相似，如表达P2X3R的神经元占比分别为52.4%和52.6%；不同大小的人和小鼠DRG神经元均表达KCNB1，但有多个mRNA（KCNB1、HCN2、CHRNA9、TRPA1、TRPV1和CRLF2）在表达水平、细胞直径分布和细胞数量分布上表现出显著差异，最显著的差异是人类DRG中肽能（CGRP）和非肽能标记物（P2X3R）大量重叠，而在小鼠中不存在这种现象。（黄翔/Lina）
小鼠与人类DRG中每个靶点的mRNA表达情况汇总表
Quantitative differences in neuronal subpopulations between mouse and human dorsal root ganglia demonstrated with RNAscope in situ hybridization.
2020.03.08, DOI: 10.1097/j.pain.0000000000001973.
研究文章；生命结构，生命机理；人，小鼠，背根神经节，痛觉，感受器，RNAscope; Stephanie Shiers, Theodore J Price; University of Texas at Dallas; USA.
DIPPER：一种用于探索衰老和退变动力学的人类椎间盘时空蛋白质组学图谱
eLife [IF: 8.140]
① 创建了一种深入、全面的椎间盘（intervertebral discs，IVD）蛋白质组学资源平台DIPPER（http://www.sbms.hku.hk/dclab/DIPPER/），整合了来自17个接受手术的患者的94份全基因组水平的数据，包括无标记蛋白质组学、转录组学、SILAC到降解组学数据类型，以及用于研究青年、衰老和退化时期的人类IVD的方法和流程；
② 建立了以单点蛋白质组（the point-reference proteomes）为参考，与其他15个临床椎间盘标本的独立转录组和动态蛋白质组（SILAC和降解组）数据集进行整合分析的策略，提高了蛋白质组学结果的稳健性；
③ 对16、59岁男性、无脊柱侧弯或变性报告的遗体捐献者IVD，进行蛋白质水平和基因活性分析，建立了腰椎水平上沿IVDs横向和前、后方向等3个高分辨率的静态空间蛋白质组点参考图；
④ 应用主成分分析、方差分析和差异表达蛋白鉴定，评估了椎间盘两个组成部分髓核（nucleus pulposus，NP）和纤维环（annulus fibrosus，AF）不同年龄/状态之间的差异，鉴定了蛋白质组的功能模块（Y1：定义NP区域；Y2~Y3：定义AF区域；Y4：参与血管生成和炎症过程），这些模块描述了年轻IVD的关键方向趋势（每个腰椎间盘细分为11个关键区域），及IVD衰老/退化的潜在解构路径；
⑤ 使用LASSO回归模型，结合高分辨率MRI检测老年椎间盘，鉴定了可预测组织水化的蛋白质（水化基质体）。（Jing Liu/Lina）
样品结构、数据类型和分析流程的示意图
DIPPER, a spatiotemporal proteomics atlas of human intervertebral discs for exploring ageing and degeneration dynamics.
2020.12.31, DOI: 10.7554/eLife.64940.
研究文章；生命发育；人，椎间盘，衰老，蛋白质组，空间蛋白质组，DIPPER，数据整合；Vivian Tam, Peikai Chen，Danny Chan；香港大学，中国
体内功能成像结合体外ISH：解码三叉神经机械感知的细胞机制
Neuron [IF: 17.173]
① 建立了一种将体内Ca2+功能成像（GCaMP6f fluorescence）和随后体外多基因原位杂交（multigene in situ hybridization, Post-Hoc ISH）联合分析的方法，并针对小鼠三叉神经神经元进行研究，揭示了触摸识别（轻柔地刷、捏、拉头发、吹气和振动）的转录组机制和Piezo2离子通道的细胞类型特异性功能，这一模式有望在整个神经系统中应用，用于揭示控制信息表征的基本原则和机制；
② 开发了一套根据转录组谱对神经元进行分类的、稳健的探针，将多重ISH图像与功能反应关联，可对三叉神经区域95.8%的响应神经元 (46/48)进行分类，并细致分析它们的响应动态；
③ ISH结合功能成像，基于确定的基因表达模式，对来自23只小鼠的1,830个机械感知神经元中的1,000多个进行细胞分类（覆盖C1~C13），提出检测和表征外部机械刺激的6个基本原则，以及区分这些原则的转录组学基础，得出神经元类别决定功能的结论，且详细遗传鉴定了一组对吹气和振动有选择性反应的神经元（C4）；
④ 张力门控离子通道Piezo2在感知温和触摸、振动和本体感受刺激(proprioceptive stimuli)中发挥着重要作用，Piezo2在所有三叉神经元中表达，对所有类型的机械感知神经元进行调节且具有明显的细胞类别特异性。（刘璐/Lina）
体内功能成像与Post-Hoc ISH对齐整合的原理示意图
Decoding cellular mechanisms for mechanosensory discrimination.
2020.11.12, DOI: 10.1016/j.neuron.2020.10.028.
研究文章；时空技术，生命机理；小鼠，神经元，机械感觉，细胞机制，scRNA-seq，原位杂交；Lars J. von Buchholtz, Alexander T. Chesler, Nicholas J.P. Ryba; USA.
机械外力驱动增强人类神经管类器官的模式化
Nature Communications [IF: 14.919]
① 开发了一个机械外力驱动的类器官装置，通过主动机械力来指导三维（3D）类器官的细胞命运、模式和形态发生，具有广泛适用性，有助产生更多可重复的、可编程的类器官形状、特性和模式，以应用于再生医学和疾病建模研究中；
② 发现在一个受限的时间窗口内（3~7 d），机械外力可促进源自单个人类多能干细胞的神经管类器官（human neural tube Organoids，hNTOs）生长，这一过程通过外力调节基质刚度（stiffness）介导增强底板（floor plate）模式；
③ 对第3（拉伸前）、5（最后拉伸点）、11天（成熟后）等3个时间点的hNTOs 的scRNA-seq分析（17,826 个细胞），鉴定到了具有背侧脑（D-11）、前脑（FB）、中间脑（II-11）、腹侧脑（V-5、V-11）、神经祖细胞（NP-5、NP-3）、神经嵴（NC）、神经嵴衍生物（NCD）、过渡状态（T-a、T-b）等特征的11个细胞簇，且随着生长，细胞多样性逐渐增强，发现细胞外基质的产生、肌动蛋白和细胞骨架的组织以及平面细胞极性相关转录表达通路与机械外力干预相关；
④ 免疫组化分析和经扰动实验验证hNTOs对拉伸的反应，在细胞内由细胞骨架收缩性和平面细胞极性介导。（王宸宇/Lina）
hNTOs中底板感应和模式化的示意图
Actuation enhances patterning in human neural tube organoids.
2021.05.27, DOI: 10.1038/s41467-021-22952-0.
研究文章；时空技术，生命机理；人，神经管类器官，拉伸，驱动，空间转录组；Abdel Rahman Abdel Fattah, Adrian Ranga; KU Leuven; Belgium.
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