JASN | 雌性小鼠急性肾损伤和恢复过程的时空转录图谱
美国圣路易斯华盛顿大学的研究人员利用scRNA-seq和空间转录组等技术，绘制了雌性小鼠肾脏缺血性损伤和恢复过程中的时空转录图谱，阐释了损伤诱导的标志物丢失和重新表达的过程。该文章于2021年10月发表于Journal of the American Society of Nephrology，以下是详细解读。
文章题目：Spatially Resolved Transcriptomic Analysis of Acute Kidney Injury in a Female Murine Model
发表时间：2021-12-01
发表期刊：Journal of the American Society of Nephrology
主要研究团队：圣路易斯华盛顿大学医学院
影响因子：10.121
DOI: 10.1681/ASN.2021081150
研究背景
急性肾损伤（acute kidney injury，AKI）又称为急性肾衰竭（acute renal failure，ARF），是指由多种病因引起的肾功能快速下降而出现的临床综合征。单细胞转录组研究包括snRNA-seq已揭示了AKI中损伤诱导的细胞状态和基因表达模式；然而，由于scRNA-seq技术缺乏空间位置信息，肾损伤后巨噬细胞和白细胞募集到受损细胞的生理机制尚不清楚。此外，绝大多数小鼠AKI研究都使用雄性小鼠，因为它们更容易受到缺血再灌注损伤（ischemia-reperfusion injury, IRI），但雌性小鼠的AKI研究仍然空白。本研究绘制的空间转录组图谱，为未来雌性AKI 的多组学和空间转录组学研究提供了一个基准。
研究方法
研究团队通过夹住雌性小鼠双侧肾蒂诱导肾脏产生IRI，进而造成AKI。通过测量血清尿素氮（BUN）、肌酐和肾小球滤过率（glomerular filtration rate，GFR）对肾损伤程度进行判定，以使雌性小鼠与先前雄性小鼠肾损伤程度一致。在诱导AKI后，选择手术后4小时、12小时、2天和6周对肾样本进行scRNA-seq，并用Visium对样本进行空间转录组测序（SrT），将肾细胞分成22个聚类，绘制细胞表达图谱，并进行了细胞互作分析。研究团队利用Seurat函数生成差异表达基因 (DEG)；使用ToppFun对DEG进行基因本体分析；使用非配对双尾 t 检验比较不同时间点基因表达的倍数变化（P<0.05）。
由于Visium测序技术分辨率有限，每个点（spot）约55 μm，含有约10~50个细胞。为了确定每个位点的细胞成分，研究团队使用SPOTlight结合scRNA-seq反卷积空间数据，并整合snRNA-seq细胞类型谱以确定空间相互作用，识别每个spot中的细胞类型和比例。
新的开源工具Giotto是用于空间表达数据综合分析和可视化的工具，为常见的单细胞表达数据处理提供了一个灵活的框架，包括质控、降维、细胞聚类和注释等。针对非单细胞分辨率的空间技术包括Visium、Giotto，通过整合scRNA-seq注释数据来估计不同细胞类型在空间中的富集。研究团队尝试采用Giotto来提高分辨率，使用能对应到组织的Leiden算法对细胞进行聚类分析，用Loupe Browser和Seurat可视化细胞聚类结果。
研究成果
1. 雌性小鼠诱导肾损伤所需时间较雄性小鼠更长
之前研究，在雄性C57BL6/J小鼠中，研究人员使用双侧肾蒂钳建立了AKI模型。该研究将AKI模型扩展到8至10周大的雌性C57BL6/J小鼠，并对肾损伤程度进行了标准化：在急性早期（4小时、12小时）、中期（2天）和晚期（6周）时间点分别收集组织和血浆，测量BUN值，并在受伤后12小时额外测量血浆肌酐和GFR。研究表明，除了在术后2天雌性BUN水平显着下降（P=0.028），雄性（每个时间点n=4~6）和雌性（每个时间点n=4~6）之间的BUN测量值，在整个损伤发生过程中具有可比性。
由于雌性和雄性小鼠的肌肉质量不同，受伤后BUN和肌酐的升高可能不相等，存在一定偏差。因此，研究人员另用荧光分析测量了GFR，确定了雌性小鼠的双侧肾蒂钳夹时间为34 min，其诱导的损伤程度与雄性小鼠的22 min相当。此外，研究团队还使用定量实时PCR测量了已知损伤标志物的浓度，发现在急性早期（12小时）和急性期（2天）两个时间点，Havcr1（肾损伤标志物1 [Kim-1]）和Lcn2（中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白[Ngal]）表达水平增加，所有损伤标志物在损伤后6周恢复到损伤前的表达水平（图1）。
图1 IRI方法建立雌性急性肾损伤模型
2. AKI细胞表达模式存在性别差异
研究人员对每个时间点的样本进行冷冻切片，并用Visium芯片捕获组织区域。利用Seurat可视化细胞标记基因表达，可以轻松对近端小管（Lrp2）和集合管（Aqp2）的表达数据可视化；然而，肾小球（Nphs1）的可视化非常有限，这反映了Visium的分辨率相对较低（图2A）。研究人员使用免疫荧光法验证了这些细胞标记物对应的细胞类型的表达模式，以证明单个小管的表达特异性，验证在SrT中实现的分辨率（图2B）。
已有肾损伤转录组资源多在雄性小鼠中构建，为了分析差异基因表达的性别特异性，研究人员将来自雄性小鼠AKI肾的SrT样本与该研究的雌性肾进行了比较，发现两种性别细胞聚类结果类型相似，但部分差异表达基因分布不同具有性别差异，如Cyp4a14、Cyp7b1、Slco1a6等（图2C、D）。
注：细胞类型包括近端小管节段1-2（PTs12）、近端小管节段3（PTs3）、远曲小管（DCT）、闰细胞（IC）、足细胞（Pod）、成纤维细胞（Fib）、粗升肢（TAL）、主细胞（PC）、尿路上皮（Uro）和脂肪细胞（Adipo)。
图2 Seurat对各细胞聚类及部分基因表达可视化，小鼠AKI肾细胞表达具有性别差异
3. 肾损伤和修复过程中几种不同的基因表达模式
肾脏具有很高的细胞复杂性，但Visium平台提供的分辨率有限。研究人员使用了新的开源工具Giotto来提高分辨率。使用带有PAGE富集的Giotto，根据之前发表的小鼠Bi-IRI的snRNA-seq中的DEG整合了细胞类型注释。然后，使用能映射回组织的Leiden算法计算细胞类型和空间关系，再次验证了Loupe Browser和Seurat的细胞类型注释结果。
研究人员还使用Giotto的富集方法，预测PTs3细胞和急性损伤的近端小管细胞的基因特征，确定了损伤和修复过程中基因表达变化的几种不同模式：许多近端小管细胞的基因在损伤后迅速下调，并通过修复（Aadat）上调（图3C）；相比之下，另一种模式如损伤标志物Lcn2 在髓质和乳头中迅速上调，在皮层中的上调程度较低。Cryab基因表现出了两种模式：它在乳头损伤时下调，在修复时上调；而在S3段，在损伤时上调，在修复时下调。
在炎症或纤维化过程中表达的基因，仅在晚期的时间点上调，表明该Bi-IRI模型中有从AKI 向CKD转变的趋势。例如，转录因子（Cfh）在AKI中起保护作用，它在对照组肾脏中的表达较低，但在6周时整个肾脏的表达上调。尽管无法从Visium数据辨别表达Cfh的细胞类型，但通过对之前IRI的snRNA-seq分析，揭示了Cfh在成纤维细胞中的独特表达。
图3 Giotto分析细胞类型和基因表达的空间关系
4. AKI中白细胞和上皮细胞存在相互作用
研究人员使用SPOTlight，利用26种细胞类型的标记基因，解卷积每个组织覆盖的spot，将每个spot内各细胞类型的比率以饼图显示；同时，将主要区域（皮质、外髓和乳头）独立投射到组织上，构建了整个肾脏的细胞类型层面的可视化模型（图4A)。
随后，研究人员绘制了不同细胞类型之间的相互作用关系图，直观地展示了细胞类型、相互作用的频率和参与互作的细胞数量（图4B)。在整个损伤-修复过程中，受伤的近端小管细胞与T细胞和巨噬细胞之间的相互作用频率增加，在Bi-IRI后维持了长达6周的细胞互作（图4B、C），这表明近端小管中的一部分细胞正经历损伤和炎症，且损伤时间超过预期。此外，从6周时间点对DEG的基因表达分析显示，纤维化和持续免疫反应的表达过程显著上调。最后，在假手术对照组、12小时和6周肾脏的代表性时间点，验证了细胞类型相互作用的变化（图4B），表明在受伤后6周，Kim-1阳性小管周围的F4/80信号增加（图4D）。
图4 SPOTlight揭示Bi-IRI 时间过程中细胞类型相互作用的变化
总结
本研究用了单细胞和空间转录组测序技术，构建了雌性AKI小鼠肾损伤和修复过程中的细胞表达图谱，定义了区域特异性和损伤诱导的标志物丢失及其在修复过程中的重新表达。该研究填补了雌性小鼠肾损伤研究的空白，为后续肾损伤研究奠定了基础。
系列导读
● JCI Insight | 空间转录组联合单细胞测序揭示小鼠AKI模型中上皮细胞和免疫细胞互作模式
●Science | Tabula Sapiens：人类多器官单细胞转录本测序图谱
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