Sci Adv | 综合分析原发肝癌的空间结构
海军军医大学国家肝癌科学中心王红阳院士、陈磊研究员团队联合清华大学古槿教授团队，利用空间转录组技术开展原发性肝癌（primary liver cancers ，PLCs）肿瘤边缘区和肿瘤内空间异质性研究，绘制了PLCs肿瘤区域、肿瘤边缘区域和正常组织区域的空间转录组图谱，这为PLCs的多种肿瘤生态系统提供了新见解，并为癌症干预提供了潜在的指导。该文章在2021年12月17日发表于Science Advances，以下是文章的详细解读。
文章题目：Comprehensive Analysis of Spatial Architecture in Primary Liver Cancer
发表时间：2021-12-17
发表期刊：Science Advances
主要研究团队：海军军医大学国家肝癌科学中心、清华大学等
影响因子：14.136
DOI：10.1126/sciadv.abg3750
研究背景
异质性仍然是癌症预防和治疗的主要挑战。大规模的癌症基因组项目已经揭示了肿瘤内（intratumor）和肿瘤间（intertumor）异质性广泛存在。据报道，PLCs是死亡率第二的恶性肿瘤，其中肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）和肝内胆管癌（intrahepatic cholangiocarcinoma，ICC）是两个主要亚型。病毒感染导致的慢性肝炎，压力、药物引起的肝损伤，黄曲霉素污染的食物，未治愈炎症及复杂的肿瘤微环境导致PLCs瘤内高度异质性。最近的单细胞组学研究，特别是scRNA-seq技术，极大地提升了我们对肿瘤细胞的异质性问题的认识，包括免疫细胞亚群和肿瘤相关基质细胞的特性。但scRNA-seq技术仍有局限性，组织解离成单细胞悬液后丢失了空间信息和形态信息，这使得研究肿瘤的空间结构变得困难。而近年发展起来的空间转录组学（spatial transcriptomics，ST）技术可以克服上述局限性。
研究策略
收集了7例肝癌患者的21例样本，包括5例HCC（HCC-1、2 、3、4、5）、1例肝内胆管癌合并肝细胞癌（cHC-1）、1例肝内胆管细胞癌（ICC-1）的癌旁、癌-癌旁边界、癌症原发灶、门静脉癌栓样本，利用Visium平台进行空间转录组测序。同时，收集7例患者的外周血样本并进行全外显子组（WES）测序。涉及的样本和研究概况见图1。
图1 PLC样本采集及处理分析工作流程图
研究成果
1. 利用ST技术探索PLCs结构
对于本研究中的ST技术，单个spot（包含8到20个细胞左右）直径为55 μm，在捕获区域，每个切片（6.5 mm×6.5 mm）包含5,000个spots；测序数据显示，每个spot的基因中位数约为3,000个。总的来说，肿瘤区域的UMI （unique molecular identifiers）数量大于正常区域的数量，这与先前的研究一致（图2A）。此外，考虑到每个spot包含多个细胞，研究人员提出了一种基于签名的策略来评估每个spot中不同细胞类型的富集程度（图2B），共注释为8种主要的细胞类型：肝实质细胞、肿瘤细胞、胆管细胞、成纤维细胞、内皮细胞、T细胞、B细胞和巨噬细胞。为了验证转录组学特征是否与组织学信息一致，研究人员将H&E染色图像与其对应的ST数据进行了比较，证实了由细胞类型标记基因表达定义的区域与病理图像高度一致。
图2 不同患者和空间位置样本聚类和基因表达热图
2. PLCs空间异质性的不同表型
为了表征PLCs的空间多样性，研究人员将来自每个患者不同部位的spots进行了聚类分析，并用UMAP展示。结果显示，HCC-1T、HCC-3T和HCC-4T中的聚类具有区域分布特征，而HCC-2T和cHC-1T中的聚类是相互交织的（图3A）。此外，HCC-3L中的细胞簇是一种独特的簇，无论是在HCC-3N中还是在HCC-3T中都没有出现（图3A）。分层聚类分析结果显示，来自相同类型区域的细胞簇总体上更相似（图3B）。
图3 PLCs空间异质性的不同表型
接下来，研究人员还使用基于基因的策略来比较不同亚群中不同细胞类型的得分，观察到间质区域的成纤维细胞和内皮细胞评分明显较高，不同肿瘤簇区域的免疫细胞评分表现出高度的多样性。通过拟合细胞类型评分的变化曲线，研究人员发现与基质区相关的细胞簇形成了成纤维细胞、内皮细胞甚至免疫细胞的变异表型（图3C）。
3. 肿瘤边缘区域的微环境特征
结合“空间连续性度”（spatial continuity degree）与另一种测量肿瘤区域整体转录异质性的指标“转录组多样性度”（transcriptome diversity degree），研究人员测量了肿瘤边缘和肿瘤区域的转录组异质性，发现HCC-1、HCC-3和HCC-4患者的L和T切片的肿瘤区域具有较高的空间连续性和较低的转录组多样性（图4A）。进一步分析发现，PLCs边界区域肿瘤纤维包膜的完整性与肿瘤细胞的空间异质性及其周围基质细胞和免疫细胞的分布密切相关，但对正常区域和肿瘤区域的标志性通路的活性影响不大（图4B~4H）。
图4 肿瘤边缘区域的微环境特征
4. PLCs瘤内异质性
通过对每个肿瘤聚类中的标志通路活性进行分层聚类，确定了两个模块（module；图5A）。模块1显示出细胞周期和代谢相关通路的高活性，而模块2在炎症、血管生成、上皮-间充质转换代谢方面具有更高的活性。HCC-1的肿瘤clusters属于两个不同的模块，T.2（代表HCC-1T中的cluster 2）为模块2，T.5和T.6为模块1，表现出不同的基因表达模式（图5B）。为了研究HCC-1中肿瘤clusters之间的通信和相互作用，研究人员选择了4个spots宽的clusters界面区域（每个簇有2个spots宽；排除了基质区域的spots；图5D），发现每个簇中的这些高表达分子可以介导相互通信，并可能作为破坏临床治疗中肿瘤细胞群落的潜在靶点（图5E）。此外，研究人员在空间上研究了不同肿瘤clusters可能的基因组驱动因素，并从匹配的bulk组织的ST数据和WES数据中推断拷贝数变异，发现从ST数据推断的拷贝数变异与批量数据一致，说明从ST数据推断的拷贝数变异是可靠的。而且，ST数据可在不同肿瘤clusters间揭示更微妙的拷贝数变化异质性（图5F）。
综上表明，肿瘤内的空间异质性广泛存在。某些肿瘤内的不同clusters具有不同的通路活性和不同的细胞来源。不同亚群间的细胞通信可能对肿瘤的生态和进化至关重要。
图5 PLCs的瘤内异质性
5. PLCs中异质性肿瘤干细胞生态位的功能分析
肿瘤干细胞（cancer stem cells，CSCs）被认为是肝癌肿瘤内异质性的重要因素。在此，研究人员集中探讨了5种常用的肝癌干细胞相关标志物：CD47、EPCAM、KRT19、PROM1和SOX9。对于每个marker，将每个患者肿瘤spots中表达量最高的前5%的spot定义为标记物阳性的CSC生态位。通过比较L/T/P部分CSC生态位的比例，研究人员发现HCC-2中CD47-、SOX9-和PROM1-阳性CSC生态位的比例逐渐增加，而EPCAM或KRT19没有表现出同样的现象（图6A）。PROM1+ CSC生态位不仅在门静脉肿瘤血栓形成中占最大比例（图6B），而且较其他阳性生态位有更高的双阳性点数量（图6C）。通过分析HCC-2P五种CSC生态位的信号通路活性，研究人员发现EMT、缺氧、肿瘤坏死因子-α和细胞凋亡通路在PROM1+ CSC生态位中表达上调（图6D）。在CD47+ CSC生态位中也观察到类似的模式。此外，研究人员在独立队列（239例HCC病例的大规模测序数据）（图5E）以及TCGA、LCI队列中也证实了PROM1/CD47水平与上述四种通路的活性呈正相关。接下来，研究人员通过比较HCC-2P在不同CSC生态位内的微环境异质性，发现PROM1+和CD47+CSC生态位中CD4+Tem细胞和cDCs显著升高（图5F），且在独立研究中也发现了类似的相关性。
综上，这些数据解释了不同CSC生态位之间的异质性，并表明PROM1+ CSC生态位可能通过增强肿瘤细胞中的某些信号和重塑其周围的肿瘤微环境，在肿瘤进展中发挥关键作用。
图6 PLCs中异质性CSC生态位的功能分析
6. 完整HCC结节内的整体异质性
研究人员收集了1例直径约1 cm的HCC，并用4个切片进行Visium ST分析（图7A）。整合了这4个部分中的spots，并通过无监督聚类得到了6个clusters。这6个clusters在每个切片上都有不同的分数（图7B、7C），根据H&E染色和不同的基因表达模式，可以标注为正常区域（cluster 4）、基质细胞区域（cluster 3/6）和肿瘤区域（cluster 1/2/5）（图7A、7D）。研究人员将完整的切片（将A到D的部分作为一个整体）分为圆中心周围的16个相同的区域（每个部分按顺时针方向分为四个区段，分别为A-1、A-2、A-3和A-4），分为g1~g18环，每个区域有5个spots宽（用圆形虚线表示）。这种情况下，cluster 1跨越D-3到B-2区，cluster 5区域分布在C-1和C-2区，而cluster 2表现出更复杂的模式（C-3到D-2的区域分布，B-1到B-4与cluster 1的混合分布；图7E）。研究人员计算了信号通路活性的中位数与到肿瘤中心的距离之间的Spearman相关系数，常观察到通路活性的异质性。即使在同一个集群中，不同的扇区和环中大多数通路呈现出多样化的活性（图7F）。特别是标志通路活性的梯度主要发生在B段和D段（图7G、7H）。
综上证实，在来自全球范围HCC（Barcelona Clinic Liver Cancer stage 0）的非常早期阶段已存在空间异质性。即使在这个直径为1 cm的微小肿瘤结节中，肿瘤细胞亚群的分布和生物学行为也不对称和均匀。
图7 同一个切面上展现的瘤内异质性
7. 三级淋巴结构的空间分布及临床意义
三级淋巴结构（tertiary lymphoid structures，TLSs）是一个异位淋巴样结构，是树突细胞成熟、抗原呈递、T细胞和B细胞的激活和分化的场所，这与抗肿瘤的免疫反应和免疫治疗反应有关。在这里，研究人员注意到HCC-5的cluster 6具有高表达CXCL13、CCL19、CCL21、LTF、LTB、CD79A/B等的特征，这些都是TLS形成的必要分子。通过与H&E染色的整合分析，cluster 6被鉴定为TLS区域。在此，研究人员选择了cluster 6中高特异性表达的前50个基因（TLS-50）作为特征基因，并测试了其识别TLS的能力。病理学家证实TLS-50可以识别TLS的区域，具有更高的信噪比（图8A）。研究人员利用TLS-50定位不同切片上TLS spots，发现TLS主要存在于交界区域（L），而不是T区和N区，尤其是在L切片的非肿瘤区域（图8B）。与基质背景相比，TLS spots富含T细胞、B细胞、DCs，这与之前的报道一致（图8C）。
图8 TLS的空间分布及临床意义
在HCC-5中，基质区CD8+ Tcm细胞（中央记忆T细胞）和CD8+ Tem细胞的得分高于TLS区，提示肿瘤细胞可能影响TLSs组成。然后，研究人员分析了TLSs组成和它们到肿瘤区域的距离之间可能的相关性，发现CD8+ Tcm细胞、CD8+ Tem细胞和CD4+ T细胞的评分与肿瘤的距离呈负相关（图8D），提示TLSs的组成和功能可能受到肿瘤细胞的影响。接下来，研究人员进一步检查了TLSs周围区域是否存在基因表达梯度，发现除已报道的促进TLS形成的典型趋化因子（CCL19、CCL21和LTB），CXCR4和TRBC2在所有7例PLC患者中也表现出梯度下降，说明它们在TLS形成和发育中的潜在作用（图8E）。最后，研究人员在239个HCC样本的bulk测序数据中，证实了在评估TLS丰度时，TLS-50标记与12-趋化因子标记作用相当。在肿瘤大小大于3 cm和BCLC B/C期的HCC中，TLS-50得分较低（图8F）；较高的TLS-50得分与TCGA合并HCC患者的预后显著相关（图8G）。
结论
利用空间转录组技术，研究人员构建了首个基于TLCs三个主要亚型的高分辨率空间转录组图谱，并确定了非肿瘤区（N）、边界区（L）和肿瘤区（T）的肿瘤微环境特征，发现肿瘤内部不同细胞亚群具有不同优势基因表达，肿瘤细胞内部亚群在彼此接触的范围（100 μm宽交界区）会发生广泛的配体-受体相互作用。最后，研究人员利用Top 50特异高表达基因集确定一个新的用于鉴定TLSs的基因集，发现其高评分与TLCs患者的预后显著相关。
该研究为TLCs的多种肿瘤生态系统提供了深入见解，并为寻找新的药物靶点和制定新的治疗策略提供了潜在资源。
系列导读
● Nature | 华大Stereo-seq助力揭示黑色素瘤细胞的生长和转移机制
● Nature Genetics | 不同肿瘤中癌细胞状态的复发及其与肿瘤微环境的相互作用
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