肿瘤研究：正确认识乳腺癌，科学治疗有方法 | 时空简讯39期
时空简讯第39期。
乳腺腺体是乳房最重要的结构之一，具有分泌乳汁、哺育后代的功能。但同时，各种乳腺疾病，如乳腺炎、乳腺增生、乳腺纤维瘤、乳腺囊肿、乳腺癌，也是当下危害女性身心健康的主要疾病之一。根据《2022中国女性乳腺健康粉红报告》显示，我国每年新增乳腺癌患者约42万人，平均每76秒就有1例确诊，已成为中国女性高发恶性肿瘤之一，且发病人群逐步年轻化。
乳腺癌作为女性健康的“头号杀手”，让众多女性“闻之色变”。其实，乳腺癌并没有想象中那么可怕，做到“早预防、早发现、早治疗”，能够极大地提高乳腺癌的治愈率和生存率。在此，我们遴选了有关乳腺癌的进展机制、治疗策略及研究工具等9篇前沿文章，展示了空间及单细胞组学技术在乳腺癌病理与诊疗方面取得的最新成果，供了解参考。
病理机制
Pathological Mechanism
乳腺国际组织（BIG）分子筛查计划：AURORA研究中的原发乳腺癌与配对转移灶的基因组与转录组分析
Cancer Discovery [IF: 39.397]
① 从9个欧洲国家收集了381例发生转移的乳腺癌患者，其中242例患者进行了靶基因测序，152例进行了RNA-seq，67例通过SNP芯片进行拷贝数变异（copy-number variation, CNV）检测，结合前瞻性收集的临床数据，确定了富含转移和预后生物标志物的基因组改变。
② 驱动基因中88%的突变是原发肿瘤和转移瘤共有的，只有在10%患者转移灶中至少有一个的“私人突变”（mutation private）。
③ 通过比较AURORA和TCGA的乳腺癌队列及META-BRIC队列数据，发现复发患者较未复发患者有更高比例的TP53突变、更高的肿瘤突变负荷（tumor mutational burden, TMB）和更低比例的PIK3CA突变；非原发病人较原发病人具有更高的TMB。
④ 在AURORA靶基因测序样本（n=242）中，原发样本与其配对转移灶之间点突变的中位癌细胞分数增加，其中HR+/HER2-和HER2+亚型的增加显著，而三阴性乳腺癌不明显；与原发性肿瘤相比，转移灶的同源重组缺陷特征更加富集。
⑤ 从Luminal A/B到HER2-E的亚型转换与TP53和/或PIK3CA突变有关；与其他亚型相比，HR+/HER2−转移乳腺癌的基因表达差异显著增大，原发灶与配对转移灶的表达差异也显著大于配对的新发（de novo）转移乳腺癌。
⑥ 在原发HR+/HER2-肿瘤中，高TMB与较短的复发时间、更短总生存期和更多的驱动因素数量显著相关；转移样本中，高TMB也与较短的总生存期显著相关。（大禹）
AURORA分子筛选的设计说明，包括基线和纵向收集样本和临床数据
Genomic and transcriptomic analyses of breast cancer primaries and matched metastases in AURORA, the Breast International Group (BIG) olecular Screening Initiative.
2021.06.28, DOI: 10.1158/2159-8290.CD-20-1647
研究文章：人，乳腺，乳腺癌，内皮细胞，多组学，转移，RNA-seq，CNV检测；Philippe Aftimos, Martine J. Piccart; Université Libre de Bruxelles, Breast International Group；Belgium.
scRNA-seq揭示人乳腺癌转移的转录多样性和生物能量转移
Nature Cell Biology [IF: 20.042]
① 利用scRNA-seq捕获和分析来自患者来源的乳腺癌异种移植模型中微转移过程中的单个癌细胞，揭示了线粒体氧化磷酸化（oxidative phosphorylation，OXPHOS）在癌症转移中的功能重要性，并突出其作为防止乳腺癌患者的转移扩散的治疗靶点潜力。
② 原发性肿瘤和微转移均显示出转录异质性，但微转移具有一个独特的转录组程序，可以高度预测乳腺癌患者的不良生存率。
③ 通路分析显示，OXPHOS是微转移中上调的首要通路，这与原发性肿瘤细胞中更高水平的糖酵解酶形成对比，流式细胞术和代谢组学分析证实了这一点。
④ 使用两种不同的乳腺癌实验转移模型，进一步发现了OXPHOS的药理学抑制作用，其能够显著减弱肿瘤转移至肺。（Lina）
微转移肿瘤细胞和原发肿瘤细胞的scRNA-seq分析
Transcriptional diversity and bioenergetic shift in human breast cancer metastasis revealed by single-cell RNA sequencing.
2020.03.06, DOI: 10.1038/s41556-020-0477-0
研究文章；人，异种移植模型，乳腺，乳腺癌，转录异质性，转移，氧化磷酸化，scRNA-seq；Ryan T. Davis, Devon A. Lawson; University of California; USA.
阐明三阴性乳腺癌肿瘤微环境的异质性：转向优化的治疗方法
Journal of the National Cancer Institute [IF: 11.577]
① 使用来自四个大型三阴性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）系列共计1,512个样本的公开转录组学和基因组数据集，研究每种TNBC分子亚型内的肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME）异质性，并通过逻辑回归模型评估TNBC分子亚型和特异性特征之间的相关性，证明了每种TNBC分子亚型都表现出与特异性免疫、血管化、基质和代谢生物过程，以及特异性免疫成分和定位相关的不同TME图谱，为TNBC患者免疫治疗的基本原理奠定了基础。
② 免疫调节亚型、完全发炎亚型与适应性免疫相关细胞群的高表达和大多数评估的免疫靶标（如免疫检查点受体）相关，表明这些“immune hot”肿瘤是免疫检查点抑制点的最佳候选者；相反，大多数间充质干细胞样和管腔雄激素受体肿瘤显示出免疫抑制和致癌表型，这从基质信号的高表达水平可以看出，表明它们是靶向调节性T细胞或免疫抑制通路（如腺苷通路）治疗的潜在候选者。
③ 基底样、管腔雄激素受体和间充质亚型表现出与基质和代谢TME特征相关的“immune cold”型，并富集于边缘受限的空间模式。
④ 染色体5q和15q区域染色体高度不稳定和拷贝数丢失的肿瘤，包括主要组织相容性复合体相关基因的基因组丢失，表明细胞毒活性降低是一种可能的免疫逃逸机制。（廖尚晶/Lina）
通过靶向三阴性乳腺癌肿瘤微环境和基因组异质性来应对免疫治疗
Unraveling triple-negative breast cancer tumor microenvironment heterogeneity: Towards an optimized treatment approach.
2019.10.29, DOI: 10.1093/jnci/djz208
研究文章；乳腺，三阴性乳腺癌，分子亚型，肿瘤微环境，靶向免疫治疗，免疫应答；Yacine Bareche, Laurence Buisseret, Christos Sotiriou; Institut Jules Bordet, Université Libre de Bruxelles; Belgium.
人体器官微流体肿瘤模型揭示患者来源的成纤维细胞和乳腺癌细胞之间的相互作用
Cancer Research [IF: 8.378]
① 将之前开发的微流体装置作为人体3D体外器官肿瘤模型，并在该模型上肿瘤和基质区域分别共培养患者来源的乳腺癌肿瘤细胞和乳腺成纤维细胞，综合功能评估（包括癌细胞迁移）和转录组分析，揭示了肿瘤-基质细胞相互作用对乳腺癌侵袭的影响。
② 侵袭性SUM-159乳腺癌肿瘤细胞-成纤维细胞相互作用对细胞侵袭的影响取决于成纤维细胞的表型。
③ 正常成纤维细胞通过减少细胞迁移、增殖和细胞长径比呈现出肿瘤抑制行为；癌症相关的成纤维细胞（cancer-associated fibroblasts，CAFs）通过诱导乳腺癌细胞中的一种新基因的表达，即糖蛋白非转移性B（glycoprotein non-metastatic B，GPNMB），增强了乳腺癌侵袭能力，从而增加了肿瘤迁移速度。
④ GPNMB的敲低会减弱CAFs对癌症侵袭的促进作用，这为了解肿瘤侵袭过程中肿瘤-基质细胞相互作用的分子机制提供了重要的见解。（刘璐）
3D器官型共培养肿瘤侵袭试验
A human organotypic microfluidic tumor model permits investigation of the interplay between patient-derived fibroblasts and breast cancer cells.
2019.04.16，DOI: 10.1158/0008-5472.CAN-18-2293
研究文章；3D器官模型，乳腺，乳腺癌，成纤维细胞，肿瘤细胞，侵袭；Danh D Truong, Mehdi Nikkhah; Arizona State University, USA.
治疗策略
Treatment Strategies
化疗联合巨噬细胞抑制三阴性乳腺癌进展
Cancer Research [IF: 13.312]
① 使用单细胞RNA和VDJ- seq技术，以及IMC等复杂的成像技术，对单药和联合治疗的三阴性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）的临床前同源p53缺失小鼠模型进行深入分析，揭示了肿瘤免疫微环境的复杂性，并强调了合理的免疫治疗组合产生的不同免疫反应。
② 利用低剂量环磷酰胺的免疫刺激作用，结合使用小分子CSF1R抑制剂或抗CSF1R抗体对肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophages，TAMs）的药理抑制作用，开发了一种可有效治疗几种高度侵袭性TNBC小鼠乳腺肿瘤和肺转移模型的治疗方案。
③ scRNA-seq表征了肿瘤浸润性淋巴细胞（tumor-infiltrating lymphocytes，TIL），包括辅助性T细胞和抗原呈递B细胞，它们在联合治疗的应答者中高度富集。
④ 在一个表现出长期治疗后肿瘤消退的模型中，高维成像技术确定了B220+/ CD86+激活的B细胞和CD4+ T细胞在治疗后长达6周的三级淋巴结构中的紧密空间定位；TAMs的转录和代谢异质性也在两个密切相关的低密度脂蛋白/间充质亚型肿瘤模型中具有不同的治疗反应特征。
⑤ 源自T12模型的小鼠TAMs特征在人类低密度脂蛋白位乳腺癌中高度保守，且TAMs特征的高表达与乳腺癌患者总体存活率降低相关；这种TAM特征可能有助于识别从环磷酰胺和抗CSF1R疗法联合治疗中获益的低密度脂蛋白水平乳腺癌患者。（Lina）
Chemotherapy coupled to macrophage inhibition induces T-cell and B-cell infiltration and durable regression in triple-negative breast cancer.
2022.06.15, DOI: 10.1158/0008-5472.CAN-21-3714
研究文章；小鼠，乳腺，三阴性乳腺癌，化疗，肿瘤相关巨噬细胞，肿瘤微环境，免疫应答，scRNA-seq；Swarnima Singh, Xiang H.F. Zhang, Jeffrey M. Rosen; Baylor College of Medicine; USA.
单细胞分析指导耐药HER2阳性乳腺癌治疗
Nature Communications [IF: 11.878]
① 在进行CDK4/6抑制剂治疗HER2阳性乳腺癌临床试验的同时，使用转基因小鼠模型构建了体内对CDK4/6抑制剂和曲妥珠单抗治疗的获得性耐药性模型，结合scRNA-seq技术，证明了耐药肿瘤也可以进行治疗，并快速确定了可以逆转这种耐药性的新联合免疫疗法。
② 在治疗过程中对不断发展的肿瘤（包括初治、反应性/残留疾病和快速复发的肿瘤）进行高通量单细胞分析，发现一种独特的可导致耐药性的肿瘤浸润免疫细胞——未成熟髓样细胞（immature myeloid cell，IMC）群。
③ 在单细胞转录组分析的指导下，证明了IMC靶向酪氨酸激酶抑制剂卡博替尼（cabozantinib）和免疫检查点阻断剂的联合应用可增强抗肿瘤免疫能力，并克服耐药性。
④ 新的联合免疫疗法能够在快速发展的HER2阳性乳腺癌中实现相当长的一段时间反应和控制获得性耐药的出现。（Lina）
scRNA-seq试验设计流程及肿瘤浸润白细胞聚类图
Single-cell profifiling guided combinatorial immunotherapy for fast-evolving CDK4/6 inhibitor-resistant HER2-positive breast cancer.
2019.08.23, DOI: 10.1038/s41467-019-11729-1
研究文章；人，小鼠，乳腺，HER2阳性乳腺癌，CDK4/6抑制剂，酪氨酸激酶抑制剂，免疫检查点阻断剂，scRNA-seq；Qingfei Wang, Siyuan Zhang; University of Notre Dame, The Indiana University Melvin and Bren Simon Cancer Center; USA.
技术工具
Technologies and Tools
CopyKAT：从scRNAseq数据推断人类肿瘤基因组拷贝数和亚克隆结构
Nature Biotechnology [IF: 54.908]
① 开发了一种集成贝叶斯分割方法并命名为非整倍体肿瘤的拷贝数染色体核型分析工具（CopyKAT；https://github.com/navinlabcode/copykat），该方法能够在人类实体肿瘤的高通量scRNA-seq数据中以平均5 Mb的基因组分辨率来估算基因组拷贝数。
② 使用CopyKAT分析了21种肿瘤中的46,501个单细胞，包括三阴性乳腺癌、胰腺导管腺癌、间变性甲状腺癌、浸润性导管癌和胶质母细胞瘤，并准确地（98％）区分了癌细胞与正常细胞类型，且无需特定的基因表达标记。
③ 将CopyKAT应用于3名患有三阴性乳腺癌个体产生的scRNA-seq数据中，揭示了克隆性亚群，这些亚群在癌症基因（例如KRAS）的表达和特征（包括上皮到间质转化、DNA修复、细胞凋亡和缺氧）方面有所不同。（庄雯）
CopyKAT分析工作流程示意图
Delineating copy number and clonal substructure in human tumors from single-cell transcriptomes.
2021.01.18. DOI: 10.1038/s41587-020-00795-2
研究文章；实体肿瘤，三阴乳腺癌，胰腺导管腺癌、间变性甲状腺癌、浸润性导管癌，胶质母细胞瘤，基因拷贝数，克隆性亚群，scRNA-seq，CopyKAT；Ruli Gao, Nicholas E. Navin; Houston Methodist Research Institute, The University of Texas MD Anderson Cancer Center; USA.
用于组织原位分析的高分辨空间转录组方法
Nature Method [IF: 28.547]
① 开发了高分辨率空间转录组学方法——HDST（High-Definition Spatial Transcriptomics），可以从含有密集空间条形码磁珠的组织切片中捕获RNA，用于空间分辨的基因表达分析，为研究健康和疾病组织结构和功能提供了更高分辨率的技术方法。
② HDST是将条形码的poly(d)T寡核苷酸沉积到2 μm孔中，通过顺序杂交和纠错策略解码它们的位置，然后将冷冻组织切片置于解码的载玻片上，染色和成像后捕获RNA，最后应用RNA-seq进行分析。
③ 将HDST应用于小鼠大脑的主嗅球（main olfactory bulb，MOB）和组织学三级乳腺癌HER2+ 患者的肿瘤切片中，证实了其是一种测量原位空间信息的高分辨方法，HDST的分辨率分别为ST（Spatial Transcriptomics）、Slide-Seq的1,400倍、25倍。（毛学彬/Lina）
HDST工作流程示意图
High-definition spatial transcriptomics for in situ tissue profiling.
2019.09.09, DOI: 10.1038/ s41592-019-0548-y
研究文章；小鼠，大脑，嗅球，乳腺，乳腺癌，原位信息，HDST; Sanja Vickovic, Gökcen Eraslan, Fredrik Salmén, Johanna Klughammer, Linnea Stenbeck, Joakim Lundeberg; Broad Institute of MIT and Harvard, KTH Royal Institute of Technology, Stanford University; USA.
雌激素调节乳腺癌中不同的转录和表观遗传细胞状态
Nucleic Acids Research [IF: 19.160]
① 在多个雌激素受体（estrogen receptor alpha，ER）阳性乳腺癌细胞系和患者来源的外植体类器官模型中，联合使用scRNA-seq和scATAC-seq精细地绘制了随时间变化的雌激素反应的异质性，确定了驱动异质性激素反应率的调节机制。
② 开发了一种基于无监督贝叶斯主题建模的计算工具：TITAN（Topic Inference of Transcriptionally Associated Networks；https://github.com/ohsu-cedar-comp-hub/TITAN），用于量化单细胞数据集中的信号传导或其他转录梯度，并与其他测试工具相比显示出更好的性能。
③ 应用TITAN发现了明显的雌激素反应特征，其中两个最不同的特征分别由ER和FOXM1驱动，出现在非重叠细胞群中，也表现出明显的染色质可及性特征，说明这些瞬时细胞状态在染色质和转录因子水平上受到严格调控。
④ FOXM1确实在雌激素刺激下被磷酸化激活，而FOXM1的沉默减弱了相关基因特征；通过分析来自患者样本的scRNA-seq数据证实了这些不同细胞群的存在，其中FOXM1特征主要存在于ER阴性细胞中。（Lina）
试验设计与TITAN工作原理图
Estrogen regulates divergent transcriptional and epigenetic cell states in breast cancer.
2022.11.01, DOI: 10.1093/nar/gkac908
研究文章；外植体类器官，乳腺，乳腺癌，雌激素受体，细胞状态，TITAN；Aysegul Ors, Alex Daniel Chitsazan, Hisham Mohammed; Knight Cancer Institute, Oregon Health & Science University; USA.
系列导读
● 单细胞及空间多组学数据分析——深挖生物学内涵，助力精准医学 | 时空简讯38期
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