Nat Biotechnol | 空间转录组技术及其发展方向
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来自美国哈佛大学和麻省理工学院的研究人员详细描述了现有的基于测序（sequencing-based spatial transcriptomics，sST）和基于成像（imaging-based ST，iST）的空间转录组技术，讨论了sST和iST的主要应用成果，并展望了未来空间转录组技术的开发方向。该综述发表于2022年10月Nature Biotechnology，以下是文章的详细解读。
文章题目：The Expanding Vistas of Spatial Transcriptomics
发表时间：2022-10-03
发表期刊：Nature Biotechnology
主要研究团队：美国哈佛大学、麻省理工学院等
影响因子：68.164
DOI：10.1038/s41587-022-01448-2
组织完整性的形成和维持需要数千个基因及其编码产物的复杂、协调的活动。在测量生物分子时，研究人员一直以来都面临着选择实验方法的关键权衡：一方面，“组学”工具可以对纯化样本中的许多生物分子进行广泛的、全面的测量；另一方面，靶向工具，如免疫染色或原位杂交，可以在完整细胞和组织中定位少量的特定分子。因此，研究人员通常将这两个阶段结合在一起。而最近ST技术的快速发展打破了这种方法学上的历史分歧。它们能够确定组织的细胞类型结构、解释细胞-细胞相互作用，以及阐明组织成分之间的分子相互作用（图1a）。为了解当前和未来的ST技术如何提高解决这些生物学问题的能力，来自美国哈佛大学和麻省理工学院的研究人员详细概述了现有的ST技术（sST、iST；图1b），在讨论sST和iST的主要应用实例时描述了用于表征、验证的关键指标和实验框架，并展望了ST技术的未来发展方向。
图1 ST在生物实验中的应用
01
sST技术及其特征
sST技术通常从构建空间索引表面（spatially indexed surface）开始，其中每个像素（pixel）都包含一个带条形码的DNA引物，该引物在二维空间中唯一标记像素的位置。然后，将组织置于表面之上，通过将RNA从组织扩散到表面或将带条形码的引物扩散到组织中，使驻留mRNA与引物接触。通常来说，在其3’末端带有poly（T）序列的引物被用于捕获整个转录组中的mRNA。
按照空间索引像素生成策略，sST技术可分为三类：（1）Visium，用微阵列点样机器人将独特的条形码传送到切片表面的固定已知位置；（2）Slide-seq，用固体微粒进行空间条形码编码；（3）华大Stereo-seq，Seq-Scope和DBiT-seq，通过rolling circle扩增或bridge扩增来局部扩增独特的条形码序列。在质量控制（quality control）中，sST技术中两个最重要的参数是单位面积的mRNA捕获灵敏度和mRNA检测的空间准确度。此外，表征和比较sST技术还涉及到测序效率（或确定特定数量的信使RNA分子所需的DNA测序量）和捕获面积（及其容纳不同大小、组成和形状的组织的灵活性）。
图2显示了跨各种技术和组织类型的选定灵敏度、分辨率指标（截至目前，新技术的性能还没有用一套一致的、标准化的组织来进行检测）。因此建立一组具有明确组织学结构的参考组织来测试不同的技术，以正确地描述、基准测试和比较新技术及改进将是非常有益的。
图2 sST技术及其特征
02
iST技术及其特征
在iST中，RNA分子通过互补杂交被荧光探针特异性标记，然后使用荧光显微镜对这些探针进行成像。为了克服光谱限制，iST新技术通常使用多轮连续成像和组合策略来检测转录本。因此，特定的iST技术在很大程度上是由其检测方式、RNAs分子的标记方式和多路复用方法，或如何在多轮连续成像中检测多个RNA转录本来定义的。这些技术主要是由寡核苷酸合成、荧光显微镜和单细胞转录组学三个领域的进步而推动的，常见的有smFISH、osmFISH、MERFISH、STARMap等。
iST中原位标记RNA分子的方法主要有基于直接探针的检测、基于酶辅助探针的检测和原位RNA分子的直接酶测序三种方法（图3）。所有检测方法都是从固定的细胞和组织开始，其中RNA分子与细胞基质交联，从而在整个处理过程中固定住它们的位置。基于iST的多路复用方法主要包括序列读出和组合多路复用两种，均是利用多轮成像来克服光谱带宽的限制。收集多轮图像数据之后，使用spots检测、图像配准和解码为空间mRNA定位三个主要图像处理步骤来生成主要ST数据。同时，与sST技术一样，iST中关键的两个数据质量参数也是敏感性和特异性（图3），这可以通过smFISH进行直接外部验证或使用内部阳性和阴性对照来评估。此外，目前整个图像领域缺乏标准化的数据格式，这使得开发和基准测试通用的iST图像处理流程变得困难。因此，iST需要通用的开源图像处理工具（https://spacetx-starfish.readthedocs.io/en/latest/），以及用于对此类工具进行基准测试的标准化主要数据集。
图3 iST的三个基本步骤及质量控制指标
03
未来ST技术的发展方向
ST技术的高速发展预示着基因组学正在向完整细胞和组织研究的更广泛技术转变。研究人员预测未来ST技术将朝着适用于原位检测转录本剪接、基因组结构变异、表观基因组修饰和调控、蛋白互作和原位蛋白测序，细胞分割和空间分辨率提高下的细胞互作研究，以及利用基因编辑分子记录技术的四维细胞转录组状态测量这三个方向发展（图4）。
图4 ST技术的发展方向
基因组学在组织中的应用代表了一个激动人心的、多方面的技术发展领域。数据和protocols的早期和简单共享是技术进步的关键催化剂。在ST中，由于方法的多样性，产生了各种各样的文件格式和数据结构，这使得数据和protocols共享更具挑战性，但也更有必要在更广泛的技术生态圈中将新方法结合起来。目前，人们已经在开发用于图像数据处理的系统化流程（https://github.com/spacetx/starfish）方面进行了努力，但还需要做更多工作来构建通用文件格式和标准化数据存储及访问通道。采用标准化组织和质量控制测量对于开发ST技术进步的共同语言至关重要也是本综述支持的观点。此外，空间基因组学的出现也提出了另一个的重要挑战，即如何促进生物学专家使用这些强大的新工具进行假设生成和检验。毫无疑问，关键在于发明和采用计算工具来分析这些新数据类型。研究人员预测空间基因组学技术的成熟和传播将成为组织和疾病生物学等领域科学发现的关键驱动力。
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