Nature Neuroscience | 小鼠大脑星形胶质细胞异质性炎症响应的时空图谱

美国纽约大学格罗斯曼医学院的研究人员利用bulk RNA-seq、scRNA-seq和空间转录组测序等技术，揭示了脑组织中神经炎性星形胶质细胞的亚状态和空间区域分布，发现星形胶质细胞不同亚型炎症响应的异质性。该文章在2021年8月发表于Nature Neuroscience，以下是详细解读。

文章题目：Neuroinflammatory astrocyte subtypes in the mouse brain

发表时间：2021-08-19

发表期刊：Nature Neuroscience

主要研究团队：纽约大学格罗斯曼医学院

影响因子：24.884

DOI：10.1038/s41593-021-00905-6

研究背景

在中枢神经系统中，星形胶质细胞执行着重要的稳态功能，包括神经递质摄取、代谢物循环和支持活跃的神经元。且其是形成血脑屏障的组成部分，保护大脑免受有毒代谢物和外周损伤。在感染、急性损伤（如中风和脊髓损伤）、神经退行性疾病（如阿尔茨海默病）和正常衰老过程中，星形胶质细胞会发生炎症转变。例如，全身炎症会引起小胶质细胞因子释放，诱导产生神经毒性反应细胞亚型。然而，这些炎症反应如何受到时间和性别影响，形成的星形胶质细胞亚群是否存在异质性，以及它们在大脑中的空间位置上的分布，尚未完全阐明。

研究策略

于小鼠腹腔注射内毒素脂多糖（lipopolysaccharide，LPS），诱发急性全身炎症，检测小鼠脑组织内星形胶质细胞的转录组变化。为了研究性别和时间对基因表达的影响，研究使用多个雌性和雄性样本，在LPS注射后3、24和72 h，对皮质星形胶质细胞进行纯化和bulk RNA-seq，找出差异表达基因，完成GO富集分析。继而，研究人员利用scRNA-seq，分析约80,000个星形胶质细胞，通过聚类共鉴定10个细胞亚群，并识别各个亚型的特异性。最后，运用空间条形码和原位杂交等空间转录组测序技术，确认了各个亚型在大脑的空间分布特征。

研究成果

1. 随着时间的推移，星形胶质细胞获得不同的炎症状态

研究人员首先对注射LPS（炎症组）或生理盐水（对照组）后3、24和72 h的小鼠，分离的皮质星形胶质细胞样本，进行bulk RNA-seq。差异分析结果显示，炎症组的基因表达出现了广泛变化。这些基因表达变化，大多集中在某个具体时间点；在743个差异基因里，只有4%的基因在所有时间点被诱导。星形胶质细胞常见的反应性标记基因Gfap 和Serpina3n ，在所有时间点上调表达。干扰素刺激基因（interferon stimulated genes，ISG），比如IIgp1、Cxcl10 和 Gbp2 ，在3 h时表达最高；在24 h时参与血管生成和血压的基因，例如Fbln5、Agt，以及参与细胞外基质重构的基因Timp1上调表达。

此外，研究比较了雌性和雄性小鼠在基线和LPS注射后24 h的转录组。在生理环境中，雌性和雄性星形胶质细胞之间只有10个差异表达基因，大多为Y连锁（如Eif2s3y）或X连锁（如Xist），这表明在正常情况下，星形胶质细胞在性别间是同质的。

图1 星形胶质细胞快速炎症响应及随着时间剧烈变化

2. 复杂的星形胶质细胞亚群占据大脑中的不同区域

研究人员收集LPS和盐水注射后24 h的小鼠星形胶质细胞，进行scRNA-seq，使用细胞类型标记基因筛选后，保留了接近8万个细胞，一共鉴定到10个亚群。这些亚群表达各自先前确定和新鉴定的标记基因，部分受层特异性基因的影响。例如，亚群1表达上皮层富集标记基因Mfge8 和Igfbp2，亚群2表达Nnat、Dbi 和Agt。大体上，细胞亚群分为灰质/上皮层富集（亚群0、1、3和8）或白质/深层/软脑膜下（亚群2、4、5、6、7和9）。

随后，研究人员对LPS和盐水注射的小鼠大脑切片，进行空间转录组测序。结合上面的scRNA-seq数据，为每个簇创建基因模块，确定了各个星形胶质细胞亚群在大脑中的解剖位置。

图2 星形胶质细胞亚型（scRNA-seq）及其大脑空间定位（空间转录组）

3. 星形胶质细胞对炎症的反应存在异质性

为了解各个细胞亚群的炎症反应，研究人员利用单细胞muscat软件的伪批量（pseudobulk）方法，进行亚群特异性的差异表达分析。发现受LPS刺激的小鼠，68%的星形胶质细胞表达LPS诱导基因Serpina3n，而对照组小鼠只有3%表达。大多数基因在亚群中显示复杂的协同调控，9个亚群中共同的差异基因有45个。然而，每个亚型都有独特的诱导基因：亚群4具有最多的特异性差异基因，共36个；亚群8，拥有18个独特的差异基因。

接着，本研究为每个亚群创建炎症基因模块，并使用bulk RNA-seq数据确定时间轨迹。研究人员识别出星形胶质细胞的早期反应亚型（亚群0、1、3、4和8）和在72 h后消退炎症反应的亚型（亚群 3、4、5、7和9）。亚群8反应最快，是一个强大的、早期依赖干扰素的炎性星形胶质细胞亚型。

图3 炎症在星形胶质细胞中引起异质的、亚型特异性转录组反应

4. 星形胶质细胞反应性亚群占据着不同的解剖位置

由于亚群4展示了最独特的差异基因，而亚群8在炎症基因方面定义最明确，且表现出强烈的早期炎症反应，研究人员针对这两个亚群进行更深入的研究。

在所有已测序的星形胶质细胞中，白质亚群4占5.9%，主要由炎症标记基因Timp1、Gap43、Hspb1、Lcn2 和Gfap 定义；同时，亚群4还表达干扰素诱导的典型基因，包括Psmb8、Ifitm3 和抗原呈递的相关基因H2-K1、H2-T23 和H2-D1。空间转录组测序结果显示，无论炎症组还是对照组，亚群4细胞都存在于Gfap⁺白质束，包括胼胝体，以及第三和侧脑室之间。然而，只有在LPS注射后，亚群4才会表达上述炎症基因。

为了验证了这些确实是星形胶质细胞，研究人员还使用RNAscope原位杂交，在LPS处理的小鼠大脑对Timp1进行可视化。在靠近脑室的白质束中发现Timp1⁺星形胶质细胞，表明亚群4的炎症成分可能是由通过脑室的外周信号诱导的。

图4 位于白质中的亚群4是LPS诱导的炎症的超级响应者

不同于亚群4，亚群8对LPS的反应更强烈、更早，且几乎只在炎症组中出现。但即使在LPS处理的小鼠，亚群8也只占已测序星形胶质细胞的2.7%。它们主要由炎症基因定义，大多是ISG干扰素刺激基因，包括IFN依赖性转录的主要调节因子Stat1和Stat2。亚群8的其他富集基因主要是在抗原处理和呈递以及IFN诱导发挥作用的GTPases，表明这些星形胶质细胞暴露于干扰素，并增强了抗原提呈能力。

空间转录组揭示了亚群8的空间位置，其在侧脑室和第三脑室周围、海马下方以及脑表面高表达。同样，研究人员利用RNAscope原位杂交技术对结果进行了验证。

图5 亚群8由干扰素反应基因定义、与血管和大脑表面相连

5. 疾病模型中的干扰素反应性星形胶质细胞

鉴于亚群8明确的炎症特征，研究人员探究了亚群8星形胶质细胞是否存在于其他具有炎症成分的疾病模型中。研究人员将本研究的单细胞数据，与先前发表的阿尔茨海默氏病5XFAD小鼠模型、多发性硬化症的EAE小鼠模型，以及急性刺伤模型的单细胞转录组数据集结合分析。发现在人类慢性疾病的小鼠模型（5xFAD、EAE）中，在单独分析数据时未发现亚群8星形胶质细胞。推测可能是由于此亚型的占比较低（~2.7%）和这些研究测序的细胞数量较少。然而，与本研究的数据集结合后，研究人员能够通过聚类识别出亚群8。在5xFAD小鼠中，亚群8的基因表达部分依赖于Trem2。在EAE小鼠大脑中，亚群8跟随疾病状态，在幼年小鼠中较低表达，在急性期最高，在缓解期间回到基线水平。同样，亚群8也可以在刺伤的小鼠模型中找到。

图6 在疾病/损伤的小鼠模型中可识别干扰素反应性星形胶质细胞

总结

本研究运用多种组学技术（bulk RNA-seq、scRNA-seq、空间转录组、RNAscope）解答具体的生物学问题。研究人员考虑了时间、空间、性别等变量，采用多个样本和多个实验数据，分析得出星形胶质细胞的不同亚型，以及它们在不同疾病中的异质性。这项研究有助于深入了解星形胶质细胞，也为神经科学研究中其他神经细胞的研究展示了良好的研究方法和范式。

系列导读

推荐阅读

联系我们

对时空组学或单细胞组学整体解决方案感兴趣的老师，可选择以下方式和我们联系，我们将及时为您进行详细的介绍：

1. 在公众号留言；

2. 发送信息至邮箱：

collaboration@stereomics.com；

3. “阅读原文”了解更多。

让我知道你“在看”