Cancer Discovery | 多区域单细胞测序解析肺腺癌的空间和细胞结构
德克萨斯大学安德森癌症中心的研究团队利用单细胞测序技术系统地研究了人早期肺腺癌（lung adenocarcinoma，LUAD）组织及癌旁和远端肺样本的单细胞数据，构建了肺上皮细胞、免疫细胞等其他多个细胞群体的转录组学数据集，揭示了早期肺癌演化的特征，为研究LUAD演化轨迹和制定早期肺癌治疗策略提供了宝贵资源。该文章在2021年5月发表于Cancer Discovery，以下是详细解读。
文章题目：Resolving the Spatial and Cellular Architecture of Lung Adenocarcinoma by Multiregion Single-Cell Sequencing
发表时间：2021-05-10
发表期刊：Cancer Discovery
主要研究团队：美国德克萨斯大学安德森癌症中心
影响因子：39.397
DOI：10.1158/2159-8290.CD-20-1285
研究背景
LUAD是肺癌最常见的组织学亚型，其发病率和死亡率都很高。制定新的LUAD早期诊断及个性化治疗策略需要对早期LUAD发展的分子和细胞动态变化有更深的理解。先前的研究发现，与实体瘤临近的正常组织学区域也会出现分子改变，而在离肿瘤相对较远的区域中这些改变则不太普遍，表明肺肿瘤的发展存在空间异质性。虽然这些研究为肺部癌症生态空间研究提供了有价值的见解，但它们主要是通过bulk测序的方式获得的，这种方法并不能获得免疫细胞群与其他细胞亚群之间的相互作用关系。
单细胞测序技术已经可以用来描绘肿瘤生态系统中分子和细胞的复杂性。比如可以用来研究晚期肺癌的转移及对靶向治疗反应的免疫微环境图谱。然而，早期LUAD中细胞的异质性、空间上演化轨迹及其相互作用仍未解决。
研究策略
研究人员对来自5个早期的LUAD癌症样本和14个匹配的多区域正常肺组织样本进行了scRNA-seq，用来描述肿瘤的演化轨迹、细胞群体的空间异质性及其表达特征，探究早期LUAD是如何发生发展的（图1）。
图1 研究目的、样本及主要发现
研究成果
1. 早期肺癌的单细胞图谱
研究人员采用scRNA-seq分析5个早期LUAD癌症样本和14个多区域正常肺组织样本（共19个样本；图2A）。其中第一个患者（P1）的3个样本质控后共有15,132个细胞，聚类分析得到了5个主要细胞簇：上皮细胞、内皮细胞、髓细胞、淋巴细胞和基质细胞。癌症样本、癌症邻近样本和癌症远处正常样本的上皮细胞比例分别为3.7%、5.4%和3.5%（平均比例为4.2%；图2B、C），与之前的研究一致。
研究人员对其余4个患者（P2~P5）样本的上皮细胞进行流式分选，然后分别对上皮细胞（EPCAM+）和非上皮细胞（EPCAM-）进行单独的scRNA-seq（图2D）。过滤后从所有患者样本中共得到186,916个有效细胞（每个细胞含1,844个基因），其中上皮细胞占比37.6%（n=70,030）。不同患者LUAD以及不同空间位置的组织的细胞组成存在差异（图2E）。
然后，研究人员分析了细胞谱系在不同人和不同样本之间的分层关系，发现癌症样本与匹配的癌旁样本的转录组特征有明显区别（图2F~I）。总体来说，相邻样本与癌症样本的聚集更紧密，而不是与更远处的正常组织，特别是在P2患者中很明显。在癌症样本中，B细胞的比例增加，自然杀伤（natural killer，NK）细胞的丰度水平降低。这些揭示了早期LUADs肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME）的转录组特征具有空间异质性。
图2 实验设计及早期肺癌单细胞图谱
2. 上皮细胞的空间多样性和肿瘤内异质性
对所有样本的70,030个上皮细胞进行聚类分析，形成了10种不同类型的上皮细胞簇（图3A、B）。研究人员通过使用一种从每个上皮细胞的scRNA-seq数据推断拷贝数变异（copy number variations，CNV）的策略，生成了CNV评分来量化细胞的非整倍体水平，发现了一类恶性富集簇（C9），其主要来自癌症样本（图3B）。上皮亚簇在癌症样本和癌旁样本之间的比例变化有明显梯度。在癌症样本中，肺泡细胞（如AT1、AT2和肺泡祖细胞）被耗竭（图3C）。
对恶性富集簇（C9, n=10,667）中的细胞重新进行了亚聚类（图3E），研究人员发现P2的LUAD中C9的CNV分数较低，而29%的C9细胞含有KRASG12D突变，且完全来自肿瘤样本，表明KRAS突变和细胞谱系特征存在空间异质性（只有肿瘤样本中有突变）和肿瘤内异质性。
P3和P5中的C9细胞几乎完全来自癌症样本（图3E）。P3的癌症样本中，C9被聚类成4个具有差异CNV谱的聚类。其中，C2、C3和C4三个细胞簇表现出显著增高的CNV，呈现出恶性细胞特征（图3G）。
研究人员通过轨迹分析发现（图3H），C4亚簇是从C2和C3进化而来的，P3的癌症样本的上皮C9簇可能起源于棒状/分泌细胞亚簇。P5的癌症样本由7个不同的CNV簇组成，揭示了一条从C4到C1的分化路径。
图3 上皮细胞的空间多样性和肿瘤内异质性
3. 淋巴细胞状态改变会形成促癌微环境
研究人员对淋巴样细胞的空间动力学和状态（n=53,882 ）进行表征，聚类得到10种不同类型的淋巴样细胞类型/状态（图4A、B）。总体上，淋巴细胞簇受到肿瘤邻近性的空间调节（图4C）。相对于正常组织，LUADs大量富含血浆细胞（SDC1+ / MZB1+）、B细胞（CD19+ / CD22+）和T调节细胞（Treg；FOXP3+）细胞。随着肿瘤邻近性的增加，研究人员注意到NK细胞（GNLY+）、先天淋巴样细胞（innate lymphoid cells，ILCs）、GZMA-hi和GNLY-hi CD4+细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocytes, CTL；CD40LG+、BATF+）、GNLY-hi CD8+ CTLs逐渐减少。
研究人员进一步对CD8+T细胞进行亚聚类分析，确定了3个大的聚类：Naïve、GZMK-hi和GNLY-hi亚群（图4D）。初始CD8+T细胞表现出较高的Naïve评分和较低的T细胞毒性评分，且其来自空间上四个区域的样本。GNLY-hi CD8+ CTLs显示出高水平的细胞毒性评分，并在LUAD样本中耗竭。CD8+CTL在细胞毒性特征评分（P<0.001）和主要细胞毒性基因NKG7、GNLY（P<0.001）的表达表现出显著的空间变异性，这些特征在癌症样本中都是最低的（图4E）。
研究人员对CD4+T细胞状态的亚簇和空间进行分析（图4F、G），发现癌症样本富含FOXP3+Treg，Tregs还表达高水平的促癌免疫检查点，包括TIGIT、CTLA4、LAG3或PDCD1，说明淋巴细胞状态和特性改变可能是早期LUAD中免疫重塑的原因。
图4 淋巴细胞状态改变会形成促癌微环境
4. LUAD中抗原呈递巨噬细胞和炎性树突状细胞耗竭
研究人员对45,803个髓样细胞进行聚类分析，识别出13种不同的亚群，包括经典型单核细胞、非经典型单核细胞、肥大细胞、中性粒细胞、M2样巨噬细胞_C1、M2样巨噬细胞_C5、过渡M2-like巨噬细胞、肺泡巨噬细胞、典型DC1、典型DC2、浆细胞样DCs、DCs LAMP3-hi和增殖髓样细胞（图5A、B）。其中，M2样巨噬细胞_C5、单核细胞（经典型和非经典型）和肥大细胞离肿瘤区域越近，比例越少，在肿瘤区域中被耗竭；而M2样巨噬细胞_C1、增殖髓样细胞和cDC2细胞在肿瘤中富集（图5A、C）。
对单核细胞和巨噬细胞（n=27,664个细胞）进行了亚群分析，研究人员确定了5个不同的亚群，并证实了M2样巨噬细胞_C1在LUAD组织中的独特富集（图5D）。LUAD组织中M2样巨噬细胞_C1存在富集，而其抗原呈递分数显著降低。离肿瘤区域越近，M2样巨噬细胞_C1的抗原呈递基因的表达水平越低（图5E、F）。在M2样巨噬细胞（C1、C5）中同样发现了抗原呈递在肿瘤区耗竭的空间模式（图5G）。
采用同样的方法，研究人员对cDC2进行了亚簇分析，发现C1亚群的炎症基因特征评分最低，而其主要在LUAD中富集（图5I~J）。离肿瘤区域越近，炎症标志物表达降低，炎症基因特征评分降低，C2亚群比例也逐渐减少（图5L~N）。
图5 LUAD中抗原呈递巨噬细胞和炎性树突状细胞耗竭
5. LUAD中配体-受体细胞互作
在受配体分析中，研究人员重点关注免疫检查点受体对（n=55）和细胞因子-受体对（n=327）（图6A）。与癌症样本和癌症近端区域互作相比，癌症样本和远处正常组织之间的L-R相互作用减少（图6B）。P2~P5病人中LUADs与其各自的正常样本相比有显著差异的细胞相互作用（图6C~F）。在多个患者中都发现了肿瘤上皮细胞上的免疫检查点蛋白CD24或LGALS9（半乳糖凝集素-9）与巨噬细胞上SIGLEC10或DC上HAVCR2之间的相互作用增强。在LUAD样本的上皮细胞中，尤其是恶性富集簇（上皮C9亚簇）中，CD24和LGALS9的表达水平总体增加（图6G、H）。综合来说，在早期LUAD中，细胞间特定通讯互作形成了促肿瘤炎症和免疫抑制状态。
图6 LUAD中配体-受体细胞互作
6. CD24表达特征的队列验证及小鼠模型验证
研究人员分析发现，相对于正常肺组织，非典型腺瘤性增生（atypical adenomatous hyperplasias，AAH）和LUAD中抗原CD24的表达逐渐增加（图7A）。CD24与上皮标记物EPCAM的表达以及促瘤水平和免疫抑制特征标记（如TIGIT、CTLA4、FOXP3和CCL19）呈正相关，而与抗肿瘤免疫标记物（如GZMB、GZMH和PRF1）呈负相关（图7B）。
早期LUAD的靶向免疫分析（MDACC cohort）显示，相对较高的CD24表达与总存活数（overall survival，OS）和无瘤间期（progression free interval，PFI）缩短相关（图7E）。与上述结果一致，MDACC cohort中CD24的表达与EPCAM的表达呈正相关，与PRF1的表达和免疫细胞毒性评分呈负相关（图7F）。研究人员对初期LUADs样本组织微阵列的分析显示，在肿瘤细胞中，CD24蛋白表达普遍存在，且与上述情况一致，CD24也与OS（P=0.04）和PFI（P=0.007）降低有关（图7G）。在同基因小鼠模型中，CRISPR介导的基因敲除或使用中和抗体减少Cd24a的表达，导致显著降低了小鼠LUAD细胞在体内的生长（图7H）。综上表明，CD24是早期LUAD中细胞间互作的核心，它与促肿瘤免疫环境形成和不良预后有关，并能在体内促进LUAD的进展。
图7 CD24表达特征的队列验证及小鼠模型验证
总结
本研究运用scRNA-seq和小鼠基因敲除模型等技术，提供了早期LUAD及其癌旁和远处肺样本的单细胞图谱。主要结论如下：1）上皮C9亚簇在不同个体之间及个体内肿瘤和癌旁样本间存在异质性；2）淋巴细胞状态和特性改变可能是早期LUAD中免疫重塑的原因；3）在早期LUAD中，细胞间特定通讯互作形成了促肿瘤炎症和免疫抑制状态；4）CD24是早期LUAD中细胞间互作的核心，它与促肿瘤免疫环境形成和不良预后有关。
总体而言，该研究提供了肺上皮细胞和免疫细胞等其他群体（如基质和内皮亚群）的转录组学数据集，以及肺癌相关的细胞相互作用，为研究LUAD的演化轨迹和制定早期治疗策略提供了高分辨率的宝贵资源。
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