Nat Cancer | 新辅助治疗预测HER2阳性乳腺肿瘤反应的空间蛋白质组学特征研究
来自美国斯坦福大学医学院的研究团队对来自新辅助TRIO-US B07临床试验中的57例HER2阳性乳腺肿瘤患者的122个样本进行多重空间蛋白质组学特征分析，发现了预测新辅助治疗有效性的生物标志物，为早期HER2阳性乳腺癌的个性化治疗提供了新途径。该文章在2021年4月8日发表于Nature Cancer，以下是文章的详细解读。
文章题目：Spatial Proteomic Characterization of HER2-Positive Breast Tumors Through Neoadjuvant Therapy Predicts Response
发表时间：2021-04-08
发表期刊：Nature Cancer
主要研究团队：美国斯坦福大学医学院等
影响因子：21.937
DOI：10.1038/s43018-021-00190-z
研究背景
人表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）阳性乳腺癌占浸润性乳腺癌的15%~30%，其侵袭性高且远期预后不佳。在早期乳腺癌患者中，HER2靶向治疗联合化疗已成为HER2阳性乳腺癌患者新辅助治疗的标准方案，显著提高了病理完全缓解（pathological complete response，pCR）率，改善了患者生存质量。然而，40%~50%的乳腺癌患者在治疗后仍有残余疾病，而其他一些乳腺癌患者可能被过度治疗。考虑到HER2靶向治疗应答的异质性，需要识别出HER2和雌激素受体状态以外的应答生物标志物。而当前，人们对肿瘤和免疫微环境在治疗过程中如何变化知之甚少，因此需要对纵向组织样本进行多路原位分析。那么这种新辅助治疗中的原位图谱在预测HER2靶向治疗反应方面是否优于治疗前的整体表达生物标志物？在这里，来自美国斯坦福大学医学院的研究团队证明了强大的生物标志物可用在新辅助HER2靶向治疗早期阶段对敏感肿瘤进行分层。
研究策略
研究人员首先使用数字空间分析（digital spatial profiling，DSP）技术研究参与新辅助TRIO-US B07临床试验的28例HER2阳性乳腺癌患者的组织样本（HER2靶向治疗14~21 d后）。HER2靶向治疗包括拉帕替尼（lapatinib）、曲妥珠单抗（trastuzumab）或两者同时使用（治疗时），以及在与HER2靶向治疗联合化疗完成后的手术时（治疗后）。随后，研究人员在来自同一试验的29名独立患者中验证了上述结果。通过分析每个样本中跨多个广谱细胞角蛋白（pan-CK）富集区域的40个肿瘤和免疫蛋白生物标志物，确定了未经治疗的乳腺肿瘤空间异质性，以及匹配的治疗活检和治疗后手术样本中癌症信号通路和微环境组成的变化。最后，研究人员基于获得的空间蛋白组织特征数据，开发并验证了一种分类器，该分类器使用在处理时测量的单个标记CD45能可靠地预测pCR，并表明与通过常规免疫组织化学测量的CD45阳性细胞计数具有相当的性能。
研究成果
1. HER2阳性乳腺肿瘤的空间蛋白质组学分析
参与TRIO-US B07临床试验（NCT00769470）的早期HER2阳性乳腺癌中接受一个周期的新辅助HER2靶向治疗，包括曲妥珠单抗、拉帕替尼或两种药物同时使用，随后每三周给予六个周期的指定HER2靶向治疗加多西他赛（docetaxel）和卡铂（carboplatin）。在HER2靶向治疗14~21 d后，获得治疗前和治疗中的核芯针穿刺活检样本；治疗后获得手术切除样本（图1a）。研究人员定义了一个由28例患者组成的发现队列，这些患者可以从所有三个时间点（治疗前、治疗中和手术时）获得福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）样品。该队列的pCR和雌激素受体状态是平衡的，并用于所有探索性分析。此外，研究人员还定义了一个来自同一试验的29名患者的独立验证队列，包含匹配的治疗前和治疗中FFPE样本，以评估模型性能。随后，研究人员利用DSP对FFPE组织切片进行多重蛋白质组学分析，并采用pan-CK富集策略来分析每个组织标本平均四个区域的癌细胞和共定位免疫细胞（共有40个肿瘤和免疫蛋白生物标志物；图1b），显示出很强的一致性。
研究人员进一步利用来自同一患者的配对治疗前和治疗中的大量基因表达数据来推断PAM50亚型，并能够与空间分辨的DSP数据进行比较。结果显示，在未经治疗的肿瘤中，免疫标志物之间的相关性非常显著，提示多个免疫细胞亚群的协同作用（图1c）；蛋白质组学水平的肿瘤间和肿瘤内变异明显，包括HER2和广谱白细胞标记物CD45（图1d）。对每个肿瘤的所有感兴趣区域（ROI）取平均值以得出每个标记物的综合评分，研究人员发现达到pCR的肿瘤和未达到pCR的肿瘤具有相似的基线HER2水平和基线CD45水平。使用按照患者阻断的线性混合效应模型，研究人员进一步发现单个DSP蛋白标记物，包括HER2和CD45，在治疗前的pCR和非pCR病例之间无显著差异（P>0.10）。
图1 未经治疗的HER2阳性乳腺肿瘤的空间蛋白质组学分析
接下来，研究人员通过DSP分析发现队列治疗中（单独进行HER2靶向治疗一个周期后）活检来研究短期HER2靶向治疗期间乳腺肿瘤和免疫标志物的治疗相关变化。结果表明，在治疗时间点与pCR最相关的蛋白质标志物是CD45和自然杀伤细胞标志物CD56。HER2和Ki67显著减少，同时还有其他下游通路成员，包括pAkt、Akt、pERK、S6和pS6，磷酸化蛋白减少相对更多（图2a)。免疫标志物，包括CD45和细胞毒性T细胞标志物CD8，在治疗后表达增加最大。值得注意的是，通过细胞类型反卷积在TRIO-US B07转录组学数据中同样观察到CD8阳性T细胞表达增加。尽管使用了不同的分析物、测量值和组织切片，但研究人员发现，DSP蛋白和bulk RNA数据集一致显示，在新辅助治疗期间，HER2信号通路和乳腺癌相关标记物减少，并伴随着免疫细胞浸润的增加。然后，研究人员检查了治疗相关变化如何根据肿瘤对HER2靶向治疗的敏感性而有所不同，并根据新辅助治疗后pCR的实现对肿瘤进行分类（图2b）。
在pCR患者中，许多免疫标志物随着治疗而增加，而在非pCR患者中，未观察到显著的治疗相关的免疫变化，且Ki67和HER2信号传导适度减少，揭示了免疫标记簇与继续实现pCR的肿瘤中癌细胞标记簇之间更强的负相关性（图2c）。不过，在来自同一队列的治疗中的bulk表达数据中未观察到pCR和非pCR患者之间的这种差异。由于雌激素受体状态和富含HER2的亚型都与对新辅助治疗的反应相关，研究人员探索了蛋白质标记物表达如何随这些协变量而变化，发现与雌激素受体阳性肿瘤相比，雌激素受体阴性肿瘤在治疗中（相对于治疗前）表现出更显著的变化（图2d）。然而，当肿瘤按结果分类时，无论雌激素受体状态如何，pCR患者都较非pCR患者表现出更显著的变化，且雌激素受体状态不能预测该队列中的pCR（P=0.47）。同样，与其他亚型相比，治疗前分类为HER2富集的肿瘤在治疗活检中表现出更显著的肿瘤和免疫标志物变化（图2e）。
图2 空间蛋白质组学分析揭示短期HER2靶向治疗后癌症信号传导和免疫浸润的变化
2. HER2靶向治疗期间异质性增加
鉴于基因组异质性是HER2阳性乳腺癌的决定性特征，研究人员接下来通过新辅助治疗评估了HER2蛋白表达在乳腺肿瘤活检的不同区域内和患者之间的变化程度。如图3a中的两个典型案例所示，在大多数情况下，每个组织样本内不同地理区域的HER2蛋白水平在治疗前表现出相对一致的HER2蛋白水平（图3b）。治疗期间，研究人员观察到在区域之间和患者之间HER2蛋白表达的异质性更大（图3c）。类似的，CD45（一种光谱白细胞标志物）在治疗后的区域之间显示出更大的异质性，且与非pCR患者相比，接受治疗的pCR患者的异质性更高。这种区域异质性可能反映了由于脉管系统、组织结构、免疫浸润或活检本身引起的药代动力学差异，强调了在治疗中分析每个样本的多个区域的重要性。
此外，研究人员还研究了治疗期间所有肿瘤和免疫蛋白标志物的区域异质性，发现在所有标记物中，DSP蛋白异质性在治疗期间相对于治疗前显著增加（图3d），与HER2类似。这些变化是普遍的，与治疗前相比，所有肿瘤和免疫标志物的异质性更大，其中HER2、pS6（肿瘤）和CD3、CD8（免疫）标记物的异质性最大。在未能达到pCR的肿瘤中，研究人员评估了整个新辅助治疗过程中的异质性。结果显示，肿瘤标志物之间的异质性在治疗中和治疗前无显著差异，但在手术（治疗后）时增加，而免疫标志物异质性在治疗中增加，随后在手术时减少。达到pCR的肿瘤在治疗中的肿瘤标志物（包括HER2）中表现出更高的蛋白质异质性，而在免疫标志物中没有表现出更高的异质性（图3e）。
图3 HER2靶向治疗过程中肿瘤和免疫标志物的异质性增加
3. 肿瘤活检的DSP揭示与pCR相关的特征
考虑到pCR患者与非pCR患者的治疗相关变化存在显著差异（图2b），研究人员评估了治疗前或治疗早期的DSP蛋白标志物状态是否可用于预测pCR。使用L2正则化逻辑回归根据治疗前和治疗中分析的多个ROI的平均DSP蛋白表达水平，或治疗前和治疗中的平均标记表达（表示为“治疗中+治疗前”）按pCR状态对肿瘤进行分类，并通过发现队列中的嵌套交叉验证评估了模型性能。结果显示，基于治疗中蛋白质表达的模型优于基于治疗前蛋白质表达的模型，且与治疗中+治疗前蛋白质表达水平的模型相当（图4a）。同样的，使用免疫和肿瘤标记物训练的分类器优于单独使用肿瘤标记物的模型（图4b）。然后，研究人员将DSP蛋白治疗中+治疗前分类器的性能与雌激素受体状态、PAM50亚型进行了比较，并再次通过发现队列中的交叉验证评估了该模型。值得注意的是，基于雌激素受体状态和富含HER2的PAM50状态的模型在该队列中表现不佳（平均AUROC=0.589）；将这两个特征或额外的病理特征添加到DSP蛋白治疗中+治疗前数据集中并不能改善AUROC（图4c）。考虑到这些患者bulk转录组数据的可用性，研究人员还使用与DSP蛋白质面板重叠的37个标记的配对治疗中和治疗前bulk RNA表达数据评估了一个模型，而该模型的性能也明显低于基于DSP蛋白质数据的模型（图4d）。
图4 富含pan-CK的配对治疗前和治疗中活检的DSP与发现队列中的病理学完全反应相关，且优于已建立的标记物
鉴于上述发现，研究人员进一步在来自TRIO-US B07临床试验的独立队列（n=29）患者中评估DSP蛋白质治疗中+治疗前分类器的性能，评估方法与分析发现队列的一样。结果显示，与发现队列类似，验证（测试）队列中的治疗中相对于治疗前的肿瘤和免疫细胞标志物变化情况一致；在最终接受pCR的肿瘤中，治疗中与治疗前的蛋白表达差异更为显著。研究人员发现，DSP蛋白质治疗中+治疗前模型在预测pCR方面的表现在发现（交叉验证评估，平均AUROC=0.733）和验证（训练测试评估，AUROC=0.725）队列相当好（图5a）。在发现队列中训练并在验证队列中测试的治疗中+治疗前分类器中，具有最大L2正则化系数的标记是治疗中CD45蛋白水平。其他具有大系数的特征包括代表TIL和巨噬细胞群（CD44、CD66B）的治疗标志物（图5b）。治疗中HER2蛋白表达在模型的系数为负数，这与治疗期间与高HER2水平相关的不良结局一致。考虑到CD45治疗值在模型中的系数最大（图5b），研究人员通过在发现队列中训练L2正则化逻辑回归模型，并在验证（测试）队列中评估该模型。结果显示，DSP CD45治疗模型的性能在发现（交叉验证评估，平均AUROC=0.920）和验证（训练测试评估，AUROC=0.749）队列中都很高（图5c）。
图5 在独立队列中验证基于DSP的空间蛋白质组生物标志物
4. 治疗中CD45 IHC测量与pCR相关
基于单个免疫标志物（CD45）高精度预测pCR这一惊人发现，研究人员利用来自发现和验证队列组合的28个患者及剩余组织，进行了CD45免疫组化（IHC） 并量化了治疗时间点肿瘤富集区域内CD45阳性细胞的百分比，以探究DSP测量是否与传统IHC测量相关（图6a）。研究人员发现，来自DSP的富含Pan-CK的CD45测量值与CD45 IHC测量值（r=0.53）和基质肿瘤浸润性淋巴细胞（tumor-infiltrating lymphocytes，TILs；r=0.41） 相关。利用具有CD45 IHC数据的子队列，使用治疗中IHC CD45阳性细胞百分比训练的模型（平均AUROC=0.871）和使用治疗中DSP CD45训练的模型（平均 AUROC=0.811）的性能都很好（图6b）。最终达到pCR的患者往往在治疗的肿瘤富集区域具有更高的CD45染色（图6c）和更高的CD45 DSP水平（图6d）；对于CD45测量，pCR和非pCR患者之间的分离均大于治疗中间质TILs、治疗中肿瘤细胞数量或治疗前HER2 FISH比率（图6d）。鉴于使用CD45 IHC和CD45 DSP水平的pCR和非pCR患者之间的显著分离，研究人员使用每个特征来建立预测pCR的阈值，证明了在治疗期间活检中分析单一标志物的潜在效用，以预测哪些患者在HER2靶向治疗期间最早期做出反应，以便相应地调整后续治疗。
图6 基于治疗中IHC的肿瘤富集区域CD45阳性细胞百分比的测量与病理完全缓解相关
结论
在这项研究中，研究人员使用DSP技术在TRIO-US B07临床新辅助HER2靶向治疗之前、期间和之后采样的乳腺肿瘤的单个5 μm组织切片上，同时分析40个肿瘤和免疫标志物。为了在增强信号的同时考虑肿瘤内异质性，研究人员采用一种pan-CK掩蔽策略，在跨多个区域中富集肿瘤细胞和共定位免疫细胞，每个样本都由约300~600个细胞组成。在来自该试验队列的纵向乳腺活检的DSP发现了与治疗相关的变化，包括治疗期间HER2和下游Akt信号显著减少，同时伴有CD45和CD8表达增加，分别与浸润性白细胞和细胞毒性T细胞一致。更重要的是，在一个独立的验证队列中，治疗过程中的CD45蛋白质表达稳定地预测了治疗反应。本研究结果确认了在新辅助HER2靶向治疗的早期阶段，强大的生物标记物可以用来实现敏感肿瘤的分层，并对后续治疗的调整具有指导意义。同时，证实了对存档组织样本进行多重原位蛋白质组学分析以通过治疗提供肿瘤和免疫细胞信号传导的近端读数的可行性和功能。
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