Nat Biotechnol | USeqFISH：用于生物组织中病毒载体趋向性分析的空间转录组学技术
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来自美国加州理工学院的研究人员开发了一种高度灵敏的空间转录组学技术——高灵敏序贯荧光原位杂交（ultrasensitive，sequential fuorescence in situ hybridization，USeqFISH），可实现完整组织中内源性和病毒RNA的空间转录组分析。利用USeqFISH，研究人员揭示了腺相关病毒（adeno-associated viruses，AAVs）载体突变体在小鼠大脑区域中的不同细胞亚型偏差，包括AAV-PHP.N对兴奋性神经元的偏差，也展示了USeqFISH在非人类灵长类动物中原位AAVs分析和多模态单细胞分析的潜在应用。该文章发表于2023年1月Nature Biotechnology上，以下是文章的详细解读。
文章题目：Spatial Transcriptomics for Profiling the Tropism of Viral Vectors in Tissues
发表时间：2023-01-26
发表期刊：Nature Biotechnology
主要研究团队：美国加州理工学院等
影响因子：68.164
DOI：10.1038/s41587-022-01648-w
腺相关病毒是体内基因传递的高效特异性载体。天然AAVs由于其致病性极小、长期持久性和具有不同感染性的血清型而被广泛应用于研究和临床领域。通过合理设计和/或定向进化对AAVs衣壳进行工程改造后，可用于有效地将静脉基因转移到中枢和周围神经系统，或优先转移到啮齿动物的某些细胞类型。
最近开发的用于非人类灵长类动物（non-human primate，NHP）大脑或肌肉的高效、微创基因访问的AAVs载体显示了工程AAV载体对靶向基因传递的适用性及临床转化的前景。为了实现完整组织中AAVs的高通量、高分辨率分析，来自美国加州理工学院的研究人员通过整合基于水凝胶的组织清除、增强的信号放大和使用序贯标记的多路复用，开发了一种高度敏感的空间转录组技术USeqFISH，可提供与受感染宿主的内源性基因相关的混合AAVs的详细转导和趋向性情况。
01
USeqFISH的工作原理及性能评估
USeqFISH包括RCA（rolling-circle amplification）和HCR（hybridization chain reaction）组合（RCAHCR）的信号放大策略，以及通过立足点介导的链置换的两步hairpin和启动子剥离方法的序贯标记策略（用于序贯标记的两步剥离）。RCAHCR是通过将探针与靶基因杂交，利用RCA生成DNA扩增子，将启动子与扩增子杂交，最后通过添加hairpins触发自发的HCR组装来进行的，而具有立足点序列（10 nt）的hairpin可通过链置换介导自发分解。研究人员通过性能评估发现，USeqFISH可以检测完整生物组织中的约50种RNA（4种颜色×13轮），通过靶向≤160 nt的序列而没有实质性损失（与HCR或scRNA-seq相比），且具有更明亮的信号。
图1 USeqFISH工作流程图
02
USeqFISH的适用性分析
研究人员针对USeqFISH是否可以检测从转染到培养细胞中的病毒基因组转录的RNA进行了研究，发现USeqFISH可以在体外选择性检测病毒基因组中短至14 nt的突变区域。此外，研究人员以每只动物1×1011个载体基因组（vector genomes，vg）的剂量，通过静脉向成年小鼠注射病毒并在注射后3周收获大脑，结果显示，使用带有针对条形码的探针的USeqFISH能够标记来自不同脑区的表达mNG（mNeonGreen）的细胞中病毒基因组的RNA转录本，支持USeqFISH通过读取唯一分配给每个病毒基因组的条形码来并行检测组织中多个系统递送的AAVs的适用性。
为了将USeqFISH应用于池系统（pooled systemic） AAVs的原位分析，研究人员进一步设计了病毒货物（cargo），包括非荧光的短编码序列和缩短的WPRE、W3SL，使其基本组件尽可能紧凑，以便为要测试的序列留出空间。结果显示，被包装在池系统AAVs中的转基因的转导和表达效率取决于注射剂量，并强调了在实验批次之间使用匹配剂量以准确验证和表征AAV衣壳的重要性。此外，即使在最小剂量107 vg下，USeqFISH也可以检测AAV转录本，但对于定量分析，每个突变体需要≥1010 vg的剂量。
为了证明USeqFISH对AAVs进行高通量、高分辨率分析的能力，研究人员设计了一个包含6个系统AAVs的池（pool；图2）。这个池包括先前确定的AAV-PHP.eB6、AAV.CAP-B10、AAV-PHP.N7、AAV-PHP.V1、 AAV-PHP.B8，以及一种新的突变体AAV-PHP.AX。通过USeqFISH分析，描述了每个突变体的已知特征，如总体转导效率和主要细胞类型趋向性，并揭示了每个突变体在跨多个大脑区域（皮质、纹状体、丘脑和小脑）的相对不同的细胞亚型趋向性。值得注意的是，AAV-PHP.AX能有效且广泛地转导神经元亚型和星形胶质细胞，当与基因调控元件配对时，其具有更高的灵活性来调节趋向性。
图2 小鼠大脑皮层中条形码系统AAV衣壳池的原位主要细胞类型趋向性分析流程
除了AAVs衣壳分析外，研究人员通过设计一个由13种突变体组成的池，该池包含AAV基因组3 ' UTR中的4个串联重复的microRNA靶位点（microRNA target sites，miRNA TSs；microRNA的互补序列），具有独特的条形码（12种具有独特miRNA TS的突变体，1种不具有miRNA TS的对照），检查了USeqFISH在原位表征AAVs系统的汇集调控货物方面的能力，证实了USeqFISH是一种适用于研究工程货物对组织中AAVs系统调控作用的有效方法。
03
USeqFISH在NHP大脑中的应用
为了成功地将工程AAVs转化为基因治疗工具，研究人员通过扩展探针设计流程纳入了狨猴（Callithrix jacchus）和恒河猴 （Macaca mulatta）两个代表性的NHP物种，并验证了USeqFISH检测内源性mRNA（如主要抑制亚型：Pvalb、Sst和Vip）和完整脑组织中表达的病毒转录本的能力（图3）。此外，研究人员通过探索USeqFISH和病毒工具组合在NHP大脑多模态原位单细胞分析中的潜在应用，证明了USeqFISH的多功能性及其与其他单细胞标记和条形码方法的兼容性，并表明USeqFISH与病毒工具相结合可用于研究跨物种组织的细胞和分子结构。
图3 VAST+USeqFISH与恒河猴大脑中7个细胞标记基因整合的代表性图像
推进工程化AAVs以精确获取细胞亚型的一个挑战是缺乏高通量、高分辨率的分析来表征体内转导情况。而本研究开发的USeqFISH能够提供与受感染宿主的内源基因相关的混合AAVs的详细转导和趋向性情况。USeqFISH具有以下三个优势：（1）适用于分析细胞培养物中的内源性和外源性引入基因，以及小鼠和NHP的完整组织；（2）在开始时完成所有基因的限速和高温步骤（探针杂交和涉及酶的RCA），随后在室温下进行多轮HCR，与其他序贯标记方法相比，简化了实验设计和仪器安装；（3）能提供异常明亮和灵敏的RNA信号可视化，只有一个短的独特序列（14 nt用于培养的细胞，40 nt用于组织）。
此外，USeqFISH还可以实现稀有和短的非编码RNA的空间单细胞分析。通过USeqFISH分析，研究人员揭示了池中每个突变体的显著特征，例如，它们在不同细胞类型中的富集，以及通过相互比较突变体同时最小化动物间变异性揭示的潜在趋向性偏差。USeqFISH可以连接空间转录组学和AAV工程，有助于推进用于靶向基因传递的病毒工具及其在基础和转化研究中的更广泛应用。
系列导读
● Nat Biotechnol | 空间转录组技术及其发展方向
● 时空组学技术：生命科学和生物医学的前沿底层工具 | 时空简讯42期
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