JGG最新综述 | 时空组学技术的研究进展、应用及挑战
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3月27日，华大生命科学研究院徐讯研究员团队在国际期刊Journal of Genetics and Genomics上发表了一篇综述文章《Spatially resolved transcriptomics: a comprehensive review of their technological advances, applications, and challenges》，从技术特点、生物信息学工具和应用的角度详细介绍了空间分辨转录组学（Spatially Resolved Transcriptomics，SRT）的最新进展和挑战，以及具有代表性的SRT应用。华大生命科学研究院成梦南博士和博士生姜宇佳为第一共同作者，华大生命科学研究院徐讯研究员和刘龙奇研究员为共同通讯作者。该综述为JGG时空组学专刊文章，以下是文章的详细解读。
文章页面截图
探索生命奥秘的能力在很大程度上是由技术的创新和突破驱动的，从350年前显微镜的发明到近些年单细胞测序技术的出现，科学界已经能够以前所未有的分辨率将生命可视化。近两年，SRT技术革命性的出现和发展填补了探索生命奥秘背后空间甚至三维（three-dimensional，3D）组织分子基础的空白，包括从全能细胞和人类疾病发展而来的不同细胞群的起源。
01
SRT技术研究进展
根据原理的不同，SRT技术在宏观上可分为基于成像的和基于测序的两类方法，这两类技术的发展更新方向都是提高分辨率和捕获能力（包括基因通量和捕获效率），但是具体的实现策略有所区别。
其中，基于成像的SRT技术通过将显色基团与探针相结合实现空间可视化，具有直接原位反映目的基因分布的优势。该方法的主要挑战包括提高信号强度和增加基因检测的数量。当前最具创新性和广泛使用的基于成像的SRT方法是seqFISH（Sequential Fluorescence In Situ Hybridization）和MERFISH（Multiplexed error-robust fluorescence In situ hybridization）。
基于测序的SRT技术不需要先验的基因序列知识，可以无偏倚地捕获目标分子。该领域的空间分辨率和捕获效率发展得非常快。基于测序的SRT技术可进一步分为基于显微切割的方法，如激光捕获显微镜结合Smart-seq2（LCM-Seq）和GEO-Seq；基于原位测序的方法，如 STARmap、HybISS和STAPmap PLUS；基于原位空间条形码的方法，如ST、Slide-seq / Slide-seqV2、HDST（High-Definition Spatial Transcriptomics） 、DBiT-seq、Stereo-seq（(SpaTial Enhanced REsolution Omics sequencing）等。
主要SRT技术发展时间线
本文首先详细描述了基于原位空间条形码的方法的四个工作流程（“Carrier”设计；组织处理和RNA捕获；逆转录和cDNA扩增；文库的构建、序列分析和数据分析），总结了这类方法的主要技术挑战：细胞分割、捕获效率、空间分辨率、捕获面积/吞吐量，并重点列举比较了最新的基于微阵列、微流体、测序载体的原位空间条形码技术特征，以指导研究人员针对不同的研究选择合适的方法。
基于原位空间条形码方法的工作流程
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SRT技术、数据分析及其应用的发展与挑战
在过去的几年中，SRT技术取得了显著的发展，但以下四个方面仍需要改进。
（1）mRNA的捕获效率。与目前scRNA-seq技术的灵敏度相比，通过更高的捕获能力得到更丰富的分子信息进行细致的细胞分类及亚型分类，目前仍是SRT技术的一个主要挑战。
（2）空间分辨率。膨胀显微镜（expending microscope，ExaM） 是一种利用可溶胀凝胶材料提高SRT技术空间分辨率的潜在技术。将高空间分辨SRT技术，如Seq-Scope和Stereo-seq，与ExaM相结合，空间分辨率将有望从500 nm进一步提高到100 nm甚至低于100 nm，这可能会带来对生物学的新见解。
（3）样本类型的普适性。目前的SRT技术大多适用于新鲜冷冻组织，不利于长期保存，而且在组织透化过程中容易发生变形和基因扩散。一些SRT技术可适用在福尔马林固定石蜡包埋组织，但效果并不理想。而多聚甲醛 (paraformaldehyde，PFA) 包埋也是一种常见的组织保存方式，这可能有助于保存组织形态和原位RNA捕获，具有更高的准确性和更少的扩散。
（4）空间多组学分析。获得空间多组学，包括分子层面的基因表达、组织细胞层面的H&E染色，以及同一组织切片内的蛋白质分布，对于充分理解不同状态的各种组织区域的基因表达谱非常重要。同时，SRT技术与其他传统分子生物学技术的结合也是未来发展的一个重要领域。
SRT相关技术、生物信息学及其应用领域的未来展望
与单细胞组学相比，高维空间分辨组学带来了海量数据，因此对数据分析提出了巨大挑战。在此，该文总结了高分辨率SRT分析中关键环节的工具和挑战。其中，数据分析工具包括用于空间矩阵生成、图像配准和细胞分割、SRT和单细胞数据集集成、基因插补和细胞通讯分析的方法。数据分析中需要解决的挑战包括跨切片的数据配准、消除批次效应、数据规范化和填补切片之间的信息空白。其他挑战有整合空间转录组学与其他多模态数据、如何识别具有基因表达模式和组织学特征一致性的空间域、如何整合来自通过不同切片处理的多个（而非单个）相邻组织的SRT数据等。
SRT已广泛应用于许多前沿领域，在空间分辨率水平上构建了跨多个物种多个组织的基因表达图谱。最吸引人的一个领域是在毫米到厘米的尺度上重建胚胎发育的时空转录组学图谱。如，通过Stereo-seq，利用小鼠、斑马鱼、果蝇等典型模式动物，绘制了胚胎发育的时空基因表达图谱。这些研究探索了与发育事件相关的空间细胞分辨率的发育轨迹和细胞-细胞相互作用。
第二个研究方向是在分子和细胞分辨下重建3D器官。如，利用Stereo-seq获得了食蟹猴大脑3D空间分辨细胞类型图谱，其中最大单张切片面积达到5 cm x 3 cm，可在全脑尺度上研究细胞分布异质性和功能。
第三个研究方向是针对疾病机制的研究。随着高分辨率SRT技术的进步，肿瘤边界和微环境可以在分子水平上被定位和定义。
SRT 技术的另一个有趣应用是在空间分辨率下研究植物的细胞景观。近期，通过Stereo-seq，根据空间信息区分了拟南芥叶片的细胞亚型，证实了高分辨率SRT为植物生物学带来新发现的能力。
SRT的近期代表性应用
总之，SRT技术可以将宏观与微观生命信息相结合，以补充和/或为现有研究提供新见解，或激发有关空间维度的新研究。随着SRT技术的不断优化、更新迭代和成本下降，未来SRT有望成为基础科学和转化医学的基础工具，全面应用于3D器官重建、胚胎发育和再生、生命演化、疾病研究等各个领域，并掀起生命科学研究的新一代浪潮。
特别关注
为了加强时空组学发育研究创新人才与研究机构间的协同合作和技术交流，深圳华大生命科学研究院将于2023年4月6日举办“时空组学技术在发育研究中的策略与成果”研讨会，综述文章共同一作成梦南博士也将作相关报告。敬请期待。
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系列导读
● Cell | Stereo-seq构建小鼠器官发育时空转录图谱
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