PD-1抑制剂治疗GBM的免疫机制

胶质母细胞瘤（GBM）是成人常见的原发性恶性脑肿瘤，经标准治疗后的总生存期平均16个月～20个月。最近一项有关复发GBM的程序性细胞死亡-1（PD-1）抑制剂的临床试验表明，仅8%的患者对PD-1抑制剂（pembrolizumab或nivolumab）出现应答。美国纽约哥伦比亚大学系统生物学系的Junfei Zhao等分析影响GBM患者PD-1抑制剂治疗效果的基因分子特征，发表在2019年3月的《Nature Medicine》杂志上。

研究者对66例成年GBM患者进行回顾性分析，在肿瘤复发时患者均接受PD-1抑制剂治疗。如符合以下一个标准则认为对治疗有应答：PD-1抑制剂治疗后，手术时采集的组织样本基本上只表现炎症反应和无肿瘤细胞，与假性进展相关； MRI成像显示，在治疗6个月的时间内肿瘤体积稳定或持续缩小。

采用单变量生存分析人口统计学数据和临床表现与对PD-1抑制剂治疗应答性的关系。为避免潜在混淆，排除生存期小于6个月的患者后，发现对PD-1抑制剂应答与整体存活率有较强的相关性；对PD-1抑制剂应答者平均生存期14.3月，高于PD-1抑制剂无应答者的10.1月。不排除生存期小于6个月的患者时，这种效果更强，应答者中位生存期为15.5个月，而无应答者中位生存期为5.7个月。中位生存期与两组患者的初诊时间和PD-1抑制剂治疗开始时间无显著差异。

分析17例患者的58个全外显子组和38个转录组，以及39例患者的癌症基因组的结果显示，33个肿瘤中有中位数47个（14～83个）的非同义体突变，均是典型的GBM。基线期应答性肿瘤的非同义单核苷酸变异（nsSNVs）并不多于非应答性肿瘤。在患者第一次手术的样本中，非应答者的nsSNV中位值为40，而应答者为26。应答性肿瘤和非应答性肿瘤非整倍体差异无统计学意义。同样，人类白细胞抗原I类（HLA-I）新表位负荷的预测，两组结果相似，非应答组中位值为45，应答组中位值为35（P=0.41）。未发现HLA杂合性与免疫治疗反应或生存期有显著关联。两组肿瘤纯度无显著性差异。

评估应答性与非应答性肿瘤中显著富集的突变（nsSNVs和indels），共鉴定出11个IDH1 R132G/H突变型肿瘤，其中4个出现在应答者，7个在非应答者中。在45例IDH1野生型肿瘤患者中，发现32例非应答者有23例PTEN突变，而13例应答者仅3例突变。PTEN在非应答性肿瘤患者中发生突变的频率明显高于应答性肿瘤患者。在癌症基因组图谱（TCGA）中，IDH1野生型GBM的458个肿瘤中，PTEN突变154个，突变率约33%；PTEN突变在非应答者中的富集程度也显著高于预测。

采用单样本基因分析（ssGSEA）每个肿瘤的PI3K AKT通路的富集分数时，观察到PTEN突变无应答性肿瘤的PI3K AKT通路活性显著升高（t检验P=0.049）。未发现CD274 mRNA表达在应答性肿瘤与非应答性肿瘤之间存在差异。13例应答者中，MAPK通路成分（包括BRAF和PTPN11）发生4个突变，而32位非应答者中只有1个突变。考虑到IDH1野生型GBM中MAPK通路突变罕见（TCGA数据库中突变率为7.8%），MAPK通路基因在应答性肿瘤中突变的频率明显高于预测。同样，应答者中MAPK通路突变也显著富集。

非应答者与应答者的肿瘤呈现不同的进化模式。与PD-1抑制剂治疗前相比，治疗后肿瘤特异性突变在2例（20号和53号）非应答者中所占比例较高，表明是遵循肿瘤进化的经典线性模型。2例应答者（55号和71号）肿瘤与分支模型更相似。PD-1抑制剂治疗前的优势克隆在治疗后不再存在，表明其改变和进化模式与治疗相关。在55号患者中，三个错义突变（MYPN R409H、UBQLN3 R159W和CYP27B1 G194E）在PD-1抑制剂治疗之前就已发生。其中一个突变（CYP27B1 G194E）高度表达,可能产生新抗原。另外2例应答者（71号和101号）中，免疫治疗后缺失一种错义突变（FNIP1 T409M和TCF12 A605S），该突变高度表达，并可能产生一种新抗原。通过识别T细胞抗原受体（TCR）和免疫球蛋白RNA序列，跟踪肿瘤内淋巴细胞的进化，在7例患者中，应答者与非应答者相比，T淋巴细胞的克隆多样性增加幅度较大（P=0.024）。免疫球蛋白RNA序列的克隆性也有类似的现象，表明B淋巴细胞有类似反应（P=0.048）。

表达亚型（前壁型、间质型和经典亚型）与肿瘤应答无关联性。通过对MSigDB的9292个基因集的富集差异分析,可观察到PD-1抑制剂治疗前和调节T（Treg）细胞相关的基因集的前几位基因集中富集（P=0.037）。富集分析表明，基因调节Treg细胞在非应答性肿瘤中更活跃。在免疫治疗后，与免疫抑制相关的基因集活跃在应答性肿瘤中，包括FOXP3和STAT3信号，以及免疫逃避信号。

PD-1抑制剂治疗后，5例肿瘤（2例应答者、3例非应答者）患者免疫组化成像未发现CD4+FOXP3+Treg细胞，提示上述FOXP3表达细胞来源于另一种细胞类型。为研究其起源，分析3例GBM的9000个细胞转录谱，包括一个PTEN突变型肿瘤。在PTEN突变型肿瘤中与该Treg细胞相关的细胞富集，与TCGA中发现的PTEN突变型样本一致。通过拓扑数据分析，确定三个主要细胞群：小胶质细胞、活跃增殖的肿瘤细胞（Ki67+）和具有迁移标记的肿瘤细胞（CD44+）的免疫抑制特征与PTEN突变型的CD44+肿瘤亚群极相关。

在PTEN突变对肿瘤免疫微环境形成的影响研究时，分析TCGA的172个样本的RNA-seq数据发现，PTEN突变与上述foxp3的转录特征显著相关，而且肿瘤纯度较低。用ssGSEA测定24种免疫细胞的单样本浸润水平分析显示，PTEN突变与肿瘤微环境的巨噬细胞、小胶质细胞和中性粒细胞水平升高显著相关。采用定量多重免疫荧光（qmIF）观察PTEN突变与肿瘤微环境结构的关系时，对17例患者（7例非应答者和10例应答者）福尔马林固定石蜡包埋肿瘤标本进行染色发现，PTEN突变型肿瘤总体CD68+巨噬细胞浸润水平较高，但差异无统计学意义。将PTEN突变肿瘤进行分类后发现，CD68+HLA-DR巨噬细胞密度明显增高。PD-1抑制剂治疗后PTEN野生型样本的CD3+T细胞密度较治疗前显著增加，而PTEN突变型样本未出现这种变化。在CD3+CD8-和CD3+CD8+T细胞中也观察到类似趋势。与PTEN野生型相比，PTEN突变型在免疫治疗前肿瘤细胞间的聚集性更强。PTEN野生型患者在免疫治疗后巨噬细胞更加密集。然而，在PTEN突变体中这种效应可逆转。

总之，研究者发现，对PD-1抑制剂治疗的免疫应答者比非应答者的生存期明显延长。基因组学和转录组学分析显示，与免疫抑制表达特征相关的PTEN突变在非应答者中显著富集，而MAPK通路改变在应答者中富集。应答性肿瘤与从消除新表位进化而来的分支模式有关，与T细胞克隆多样性和肿瘤微环境的差异相关。作者指出，PD-1抑制剂并未改善GBM患者的整体生存期，但部分基因亚型仍具有获益的机会，需要进一步探索。

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